La evolución de las proteínas reproductivas y la diversificación del espermatozoide

1. Introducción

La evolución del sexo ha sido un tema de interés y debate científico desde la emergencia de la teoría de la evolución. A nivel celular, los últimos artífices encargados de culminar la reproducción sexual son los gametos: el espermatozoide y el óvulo. Dada su vital importancia para la supervivencia y la prevalencia de las especies, el conocimiento de estas dos células ha sido una de las principales inquietudes del ser humano a lo largo de nuestra historia. Particularmente, un gran número de hipótesis y estudios sobre el sexo se han enfocado en el espermatozoide, debido a su vital papel como transportador del material hereditario masculino y a su implicación en la fertilidad.

Los espermatozoides son células extremadamente especializadas y experimentan cambios genéticos, moleculares y fisiológicos que no se observan en otras células (Roldan y Gomendio, 2006). Desde el punto de vista evolutivo, los espermatozoides constituyen un modelo celular de interés excepcional, ya que se encuentran entre las células más divergentes de los seres vivos, presentando tamaños y formas muy variadas (Pitnick y col., 2009). Durante los últimos 50 años se han llevado a cabo numerosos estudios para tratar de comprender los principios básicos y las fuerzas evolutivas que rigen su enorme diversificación. El cúmulo de estas investigaciones ha resultado en la identificación de distintas fuerzas selectivas que dirigen la adaptación de rasgos relacionados con la morfología, almacenaje y función del espermatozoide (Birkhead y col., 2008). Un factor determinante en la diversificación del espermatozoide son las fuerzas de selección sexual poscópula (SSPC), que implican todas aquellas barreras y desafíos que afrontan los espermatozoides desde su entrada en el tracto femenino hasta la fecundación. La SSPC va a imponer, por tanto, un control selectivo sobre la probabilidad de fecundación en función de las dotaciones genéticas y cualidades fenotípicas de los espermas (Birkhead y Pizzari, 2002). A pesar del amplio conocimiento sobre los rasgos que han permitido a los espermatozoides y al eyaculado adaptarse tanto a sus ambientes reproductivos como a las fuerzas de SSPC, las bases moleculares de estos cambios adaptativos han permanecido inexplorados durante largo tiempo.

Las proteínas reproductivas –que aquí definiremos como todas aquellas que actúan después de la cópula e intervienen en el transporte, almacenaje y función de los gametos, así como en la fecundación– son cruciales en el sentido biológico, debido a que contribuyen a la generación de nuevos individuos. En términos evolutivos, dichas proteínas son elementos trascendentales por tres motivos principales: 1) afectan al resultado de las fuerzas de selección sexual poscópula, 2) median los conflictos reproductivos entre los sexos y 3) contribuyen a la formación de barreras de aislamiento reproductivo poscopulatorias y precigóticas (PCPZ), lo que conduce a la formación de nuevas especies. Un aspecto interesante es que los genes que las codifican (a partir de aquí los denominaremos genes reproductivos) evolucionan con gran rapidez (Swanson y Vacquier, 2002); sin embargo, son pocas evidencias que han demostrado un impacto directo de la SSPC sobre la evolución adaptativa de los genes reproductivos.

Los últimos avances en las herramientas genómicas han permitido identificar las colecciones de genes expresados en los tejidos reproductivos. No obstante, el espermatozoide maduro es una célula transcripcionalmente inactiva y, por lo tanto, los métodos de transcriptómica no han sido eficaces sobre este sistema; tal obstáculo se ha visto superado con la aplicación de la proteómica al estudio del espermatozoide. El desarrollo de herramientas de alto rendimiento basadas en espectrometría de masas (EM) ha permitido su utilización para caracterizar la composición molecular del espermatozoide en multitud de especies (McDonough y col., 2016). En este capítulo revisamos el gran progreso logrado en la identificación masiva de proteínas del espermatozoide a través del uso de técnicas basadas en EM, y cómo estos métodos han contribuido a una mayor comprensión de la composición molecular del gameto masculino. A continuación, discutiremos cómo las técnicas de transcriptómica y proteómica se pueden integrar con análisis de genómica comparativa para identificar los grupos de genes reproductivos sujetos a selección positiva, y cómo estos hallazgos nos dan una idea de las fuerzas selectivas que han dirigido la evolución de los sistemas de reproducción. Por último, hablaremos de cómo los métodos emergentes de proteómica cuantitativa se pueden aplicar para conocer las respuestas primarias del espermatozoide a episodios de SSPC.

2. Caracterización del proteoma del espermatozoide

El espermatozoide maduro es una célula idónea para emprender estudios de proteómica, por tres razones: 1) es accesible, ya que se puede extraer fácilmente del eyaculado o de tejidos de almacenaje, 2) se puede purificar fácilmente y 3) supuestamente no tiene actividad transcripcional ni traduccional. Los métodos tradicionales para analizar la composición del espermatozoide normalmente se basaban en el uso de anticuerpos o geles en 2D, identificando un número muy limitado de proteínas. Empero, el desarrollo de técnicas de proteómica a partir de EM, ha posibilitado identificar colecciones mucho más amplias de proteínas del espermatozoide y con mayor precisión. Es por ello que durante la última década se han registrado avances prodigiosos en el conocimiento de la composición molecular del espermatozoide (Oliva y col., 2009; Karr y Dorus, 2012; McDonough y col., 2016).

El protocolo estándar de un análisis proteómico basado en ES incluye 1) la extracción de las proteínas de la célula o tejido, 2) la digestión de las proteínas por proteasas, 3) la separación de los péptidos, 4) el análisis de los péptidos en un espectrómetro de masas y 5) la identificación de péptidos y las correspondientes proteínas con base en la información de los espectros (fig. 1). La aplicación de técnicas de alto rendimiento basadas en EM ha permitido caracterizar el proteoma del espermatozoide en diversos organismos modelo como el humano (Homo sapiens) (Amaral y col., 2014), el ratón (Mus musculus) (Baker, Hetherington, G.M. Reeves, y col., 2008; Dorus y col., 2010; Chauvin y col., 2012), la rata (Rattus norvegicus) (Baker, Hetherington, G. Reeves, y col., 2008), el toro (Bos taurus) (Peddinti y col., 2008), la mosca de la fruta (Drosophila melanogaster) (Dorus y col., 2006; Wasbrough y col., 2010) o el nemátodo Caenorhabditis elegans (Ma y col., 2014). Gracias al avance de la genómica y al gran crecimiento de especies cuyo genoma se ha secuenciado y anotado, en los últimos años también se ha obtenido el proteoma de especies que no son modelo experimental, como por ejemplo el macaco Rhesus (Macaca mulatta) (Skerget y col., 2013), la trucha arcoíris (rainbow trout) (Nynca y col., 2014) o la mariposa Manduca sexta (Whittington y col., 2015). Estudios recientes han demostrado que una larga proporción del proteoma del espermatozoide se conserva entre especies distantes filogenéticamente (Dorus y col., 2006; Whittington y col., 2015; Bayram y col., 2016). Esta cualidad permitirá llevar a cabo análisis de proteómica comparativa que incluyan organismos no modelo y que a menudo se emplean en estudios ecológicos y evolutivos (ver sección 6).

Figura 1. Protocolo de extracción e identificación de proteínas del espermatozoide. El paso inicial es aislar los espermatozoides de su medio (puede ser del eyaculado o del tejido de almacenaje, dependiendo el organismo); se extraen las proteínas de las células totales o de compartimentos subcelulares, para lo que hay que realizar un fraccionamiento subcelular previo. Las proteínas extraídas normalmente se separan en geles de poliacrilamida (PAGE), mediante el uso de geles 1D (1D-PAGE) o 2D (2D-PAGE). Las proteínas se escinden de los geles y se digieren (regularmente con tripsina) para generar los péptidos, que se separan (comúnmente por cromatografía líquida) y se analizan por espectrometría de masas. Los datos de espectrometría finalmente son identificados con proteínas mediante algoritmos de búsqueda en bases de datos. Figura basada en el esquema Amaral y col., 2014. Imágenes tomadas de Van der Velden y col., 2011 (gel 1D), Wikimedia Commons (gel 2D), Wikipedia (Espectrómetro), Separation Science (espectros) y Findlay & Swanson, 2010 (identificación de proteínas).

La caracterización del proteoma completo del espermatozoide se ha complementado, en algunos casos, con estudios donde se han analizado regiones subcelulares, tales como la superficie de la cabeza (Brewis y Gadella, 2010), la matriz acrosomal (Guyonnet y col., 2012) o las estructuras accesorias del flagelo (Cao y col., 2006). Estos análisis regionales han permitido identificar proteínas que, por ser menos abundantes, no se habían encontrado previamente en los estudios del proteoma completo, aportando colecciones de nuevas proteínas. Además, el fraccionamiento de estructuras subcelulares permite la identificación de proteínas que tienen funciones reproductivas específicas; un ejemplo es la caracterización del proteoma de la superficie del espermatozoide para reconocer proteínas implicadas en la interacción de gametos (Stein y col., 2006; Zigo y col., 2013; Kongmanas y col., 2015). Por otra parte, algunos trabajos se han centrado en analizar las modificaciones postraduccionales que experimenta el espermatozoide durante la capacitación (Ficarro y col., 2003; Arcelay y col., 2008), así como las proteínas que sufren cambios durante el tránsito del espermatozoide a través del epidídimo (Labas y col., 2015; Skerget y col., 2015).

Una ventaja que presenta la identificación de proteínas con EM respecto de los métodos de transcriptómica es que se asegura la presencia de la proteína en un determinado tejido, lo cual es aún más destacable en el caso del espermatozoide, ya que el testículo es el tejido con mayor actividad transcripcional y la expresión génica durante las espermatogénesis está regulada por mecanismos extremadamente complicados (Chocu y col., 2012; Soumillon y col., 2013). La complejidad de los mecanismos de regulación de genes y transcritos durante la espermatogénesis es la causa de que el testículo sea el tejido que presenta la correlación más baja entre los niveles de abundancia de mRNA y proteína (Cagney y col., 2005; Chocu y col., 2012; Vicens y col., 2017). Por esta razón, un estudio adecuado de espermatogénesis debería integrar tanto análisis masivos de expresión génica, como métodos de proteómica.

3. Evolución de las proteínas reproductivas

Desde que Darwin (1871) formulara su teoría sobre la selección sexual, muchos investigadores se han interesado en estudiar la evolución del sexo con el fin de comprender los factores que han generado la amplia diversidad de sistemas reproductivos que se observan en la naturaleza.

Este campo cobró mayor atención cuando se empezaron a caracterizar las primeras proteínas reproductivas y se observó que éstas presentan secuencias muy divergentes entre especies cercanas (Swanson y Vacquier, 2002). Lo anterior constituyó un hallazgo sorprendente, pues debido al papel esencial de la reproducción sexual para la supervivencia de las especies se esperaba que las proteínas reproductivas estuvieran altamente conservadas. Sin embargo, este fenómeno se podía observar desde la perspectiva opuesta: las proteínas reproductivas pueden evolucionar para ser más efectivas y competitivas y, por tanto, contribuyen al mayor éxito reproductivo de los organismos. Su rápida evolución es un patrón recurrente que se ha advertido en grupos tanto de animales como de plantas, así como en diferentes etapas de la reproducción (Swanson y Vacquier, 2002; Clark y col., 2006; Turner y Hoekstra 2008; Karr y col., 2009; Wilburn y Swanson, 2015).

Un método para estimar la tasa evolutiva de una proteína se basa en comparar la secuencia de ADN codificante entre diferentes especies, lo que permite estimar el parámetro dN/dS, también conocido como omega (ω), que es el cociente entre las mutaciones no sinónimas –aquellas que modifican el aminoácido para el que codifica el codón– en sitios no sinónimos (dN) y las mutaciones sinónimas –las que conservan el aminoácido debido a la degeneración del código genético– en sitios sinónimos (dS). A partir del valor se puede inferir el perfil evolutivo de la proteína; un valor de ω < 1 indica que la proteína está conservada, ya que la selección ha ido eliminando las mutaciones que alteran los aminoácidos, lo que se conoce como selección negativa o purificante. Un ω ~ 1 se obtiene en genes que han acumulado mutaciones por relajación de la selección y se considera que han evolucionado neutralmente, ejemplo de esto son los pseudogenes que pierden la funcionalidad por la fijación de mutaciones deletéreas. Existen genes que muestran ω > 1, indicando que las mutaciones en la proteína han sido favorecidas por selección, lo que se conoce como selección positiva o evolución adaptativa. Las estimas de ω para una secuencia completa suelen ser < 1, ya que la mayor parte de las proteínas están sujetas a fuertes presiones selectivas; también es frecuente que la evolución adaptativa sólo actúe en algunos episodios de la historia evolutiva de la proteína. Por estos motivos, para detectar selección positiva en las proteínas y en los organismos se han desarrollado métodos capaces de estimar en codones o linajes específicos (Yang, 2002).

La constante identificación de proteínas reproductivas que experimentan selección positiva llevó a asumir que la mayoría de aquellas implicadas en la reproducción evolucionan rápidamente en respuesta a las fuerzas de selección sexual. No obstante, los avances recientes en los métodos de genómica y proteómica han posibilitado reconocer el repertorio de genes y proteínas que se expresan en tejidos reproductivos como el testículo (Turner y col., 2008), el epidídimo (Dean y col., 2008) o las glándulas accesorias (Dean y col., 2009). Los estudios revelaron que la mayoría de las proteínas expresadas en los tejidos reproductivos se encuentran altamente conservadas, mientras que sólo una pequeña proporción de proteínas presentan señales de selección positiva; además de que las proteínas que muestran tal señal son casi exclusivamente aquellas que se mezclan con los espermatozoides en el eyaculado, como las proteínas del fluido seminal en mamíferos (Clark y Swanson, 2005; Dean y col., 2009), las proteínas seminales accesorias en Drosophila (Swanson y col., 2001; Wolfner, 2002; Findlay y col., 2009), o las proteínas secretadas por el epidídimo que se unen a los espermatozoides durante la maduración (Dean y col., 2008).

En el caso del espermatozoide, un primer estudio analizó la evolución de un grupo de proteínas específicas del espermatozoide en mamífero (Torgerson y col., 2002), el cual reveló que muestran una mayor divergencia (medida como dN/dS) que los genes expresados en otros tejidos. Sin embargo, sólo se detectó evidencia de selección positiva para cuatro de los 19 genes analizados. El primer estudio en el que se combinaron análisis de proteómica y evolución molecular se llevó a cabo en el espermatozoide de Drosophila melanogaster (Dorus y col., 2006). En este trabajo se detectó que las proteínas del espermatozoide evolucionan con un promedio similar a las de tejidos no reproductivos, lo que implica que la mayoría se encuentran conservadas y sujetas a selección purificante (fig. 2A); además, no se identificó ninguna proteína del espermatozoide experimentando selección positiva. En un trabajo posterior se re-analizó el proteoma del espermatozoide de D. melanogaster empleando herramientas proteómicas más sofisticadas (Wasbrough y col., 2010). Estos exámenes permitieron identificar un catálogo mucho más amplio de proteínas, y gracias a la disponibilidad de un mayor número de genomas secuenciados en especies de Drosophila, se realizaron análisis mucho más robustos que volvieron a mostrar que la tasa evolutiva promedio de las proteínas del espermatozoide es significativamente menor que la de proteínas de las glándulas accesorias. Por otra parte, revisiones estadísticas de selección detectaron que sólo 77 genes del espermatozoide (8% del total) presentan evidencia de selección positiva. Tales resultados corroboran que el espermatozoide está sometido a una fuerte selección purificante.

Posteriormente, Dorus y col., se centraron en conocer las fuerzas selectivas que han dirigido la evolución del espermatozoide de mamífero. Para ello, combinaron los catálogos de proteínas que se habían identificado en el espermatozoide de ratón, por estudios proteómicos previos, con una colección propia obtenida a través de análisis de EM/EM (Dorus y col., 2010). En este estudio se determinó la tasa evolutiva de cerca de mil genes mediante análisis interespecíficos, sirviéndose de las secuencias de ratón y otras especies de mamíferos. Se identificó que los genes que codifican para proteínas de la superficie del espermatozoide (incluyendo proteínas de membrana y el acrosoma) evolucionan significativamente más rápido que el resto del proteoma (fig. 2B); además, una mayor proporción de proteínas de la superficie del espermatozoide muestran evidencia de selección positiva. Estos resultados sugieren que diversas fuerzas selectivas, tales como la selección sexual o la respuesta inmune, podrían estar dirigiendo la evolución adaptativa de las proteínas de membrana y el acrosoma, ya que éstas son las proteínas que eventualmente se exponen al ambiente extracelular y a las interacciones con otras células.

Más adelante, Vicens y colaboradores llevamos a cabo un estudio comparativo del proteoma del espermatozoide de ratón. En esta ocasión, se comparó la evolución de diferentes grupos de proteínas que se clasificaron con base en su papel funcional en el espermatozoide (Vicens, Lüke, y col., 2014). Los análisis evolutivos arrojaron que las proteínas del espermatozoide implicadas en la interacción con el óvulo presentan una evolución más acelerada (fig. 2C); además, se observó que el grupo de interacción de gametos registra un mayor porcentaje de proteínas bajo selección positiva respecto de los demás grupos funcionales (fig. 2D). Estos resultados se fundamentan en estudios retrospectivos, en los que se ha identificado selección positiva en diversas proteínas implicadas en la fecundación de mamíferos (Swanson y col., 2003; Turner y Hoekstra 2008a; Vicens, Montoto y col., 2015). Otro grupo que mostró una alta proporción de proteínas bajo selección positiva fue el implicado en la movilidad del espermatozoide. Los anteriores resultados sugieren que la velocidad de nado puede ser un rasgo adaptativo en escenarios de competencia entre machos (ver sección 4) y están soportados por las evidencias previas de que algunas proteínas que regulan la movilidad del espermatozoide presentan cambios adaptativos (Torgerson y col., 2002; Podlaha y col., 2005; Dorus y col., 2010).

Figura 2. Evolución del proteoma del espermatozoide en diferentes especies.
A) Estimación de la tasa evolutiva promedio del proteoma del espermatozoide de Drosophila Melanogaster y su comparación con proteínas no reproductivas, proteoma de las glándulas accesorias y proteínas accesorias (ACPs). En la parte inferior se muestran las comparaciones estadísticas respecto del proteoma del espermatozoide y de las glándulas accesorias. NS: no significativa, ++: p < 0.01. Modificada de Dorus y col., 2006. B) Estimación de las tasas evolutivas de los diferentes componentes subcelulares del espermatozoide de ratón. Se muestran las estimas promedio para el proteoma completo del espermatozoide, las proteínas de membrana y el flagelo. Las tasas evolutivas se calcularon para ratón mediante comparación con ortólogos de otros mamíferos; se muestran diferencias significativas entre proteínas de membrana y el resto del proteoma (* p < 0.01). Modificada de Dorus y col., 2010. C) Tasa evolutiva promedio de genes clasificados en diferentes categorías funcionales del espermatozoide. D) Proporción de genes sujetos a selección positiva en las diferentes categorías funcionales. SMG: espermatogénesis; MET: metabolismo; MOT: movilidad; CAP: capacitación; AR: reacción acrosomal; SEI: interacción espermatozoide-óvulo. Modificada de Vicens y col., 2014.

Los dos análisis evolutivos sobre el proteoma del espermatozoide de ratón aquí descritos, junto con las evidencias mostradas por estudios retrospectivos, sugieren que las interacciones moleculares que ocurren entre el espermatozoide y el óvulo durante la fecundación podrían ser una diana primaria de las fuerzas de selección sexual. Esto es consistente con lo observado en invertebrados marinos, en los que se ha visto que las proteínas implicadas en el reconocimiento y fusión de gametos evolucionan rápidamente y muestran intensas señales de selección positiva (Vacquier y Swanson, 2011). La rápida divergencia de proteínas del espermatozoide implicadas en la fecundación parece ser resultado de un proceso de coevolución con proteínas de la superficie del óvulo (Clark y col., 2009; Claw y col., 2014; Vicens y Roldan, 2014) y esto podría tener implicaciones en la compatibilidad gamética y el aislamiento reproductivo (Palumbi, 2009; Vacquier y Swanson, 2011).

Como conclusión diremos que, a pesar de que los primeros estudios que analizaron las pocas proteínas que tenían una función conocida en el espermatozoide encontraron un gran impacto de la selección positiva (Wyckoff y col., 2000; Swanson y Vacquier, 2002; Torgerson y col., 2002; Clark y col., 2006; Turner y Hoekstra, 2008), los resultados obtenidos con el análisis de amplia escala sugieren que sólo una pequeña porción del proteoma de los tejidos reproductivos y el espermatozoide experimenta evolución adaptativa. Además, los focos adaptativos parecen concentrarse en pequeños subgrupos de proteínas que presentan localizaciones y funciones específicas, como por ejemplo las proteínas de la membrana del espermatozoide implicadas en el reconocimiento de gametos. La heterogeneidad evolutiva localizada dentro de los tejidos reproductivos masculinos y el espermatozoide podría ser resultado de una compartimentalización de la adaptación en respuesta a las fuerzas de SSPC, cuyo tema abordaremos en el siguiente apartado.

4. Fuerzas de selección sexual poscópula

Por su función, el espermatozoide y los tejidos reproductivos deben ser un foco de acción de las fuerzas de selección sexual poscópula (SSPC), las cuales implican la competición entre los eyaculados de los machos, un fenómeno conocido como competición espermática (Pizarri y Parker, 2009), así como una selección diferencial del eyaculado por parte de la hembra, que pueden derivar de un conflicto sexual o de una elección críptica de la hembra (Pitnick, Wolfner y Suarez, 2009).

La competición espermática se define como la competencia que ocurre entre los espermatozoides de diferentes machos por fecundar un ovocito (Parker, 1970; Birkhead y Moller, 1998; Pizarri y Parker, 2009), Por tanto, este fenómeno afecta a especies polígamas, en las cuales los ovocitos se pueden encontrar con el eyaculado de varios machos. La competición espermática ha tenido un papel muy importante en la evolución de los sistemas reproductivos y ha promovido la adquisición y adaptación de numerosos rasgos anatómicos, fisiológicos y comportamentales dirigidos a aumentar la probabilidad de éxito de fecundación de los machos (Dixson y Anderson, 2004; Pizarri y Parker, 2009). Una respuesta primaria a la competición espermática es el incremento del tamaño de los testículos, que tiene como fin aumentar la producción de espermatozoides (Soulsbury, 2010; Ramm y col., 2014). Por otra parte, se ha observado que dicha competición ha promovido la evolución de diversos rasgos cualitativos del espermatozoide, lo que confiere a los machos de las especies promiscuas una mayor eficiencia de fecundación (Pizarri y Parker, 2009; Fitzpatrick y Lupold, 2014); entre estos rasgos se incluyen la viabilidad, la movilidad, la morfología de la cabeza, las dimensiones de los diferentes componentes del espermatozoide, la eficiencia de desarrollar la capacitación y la reacción acrosomal, mismos que se han correlacionado tanto con la fertilidad como con los niveles de promiscuidad (Hunter y Birkhead, 2002; Gomendio y col., 2006; Gómez Montoto, Magaña, y col., 2011; Gómez Montoto, Varea Sánchez, y col., 2011; Lupold, 2013; Tourmente y col., 2013). La competición espermática da como resultado que los eyaculados de los machos tengan una fecundación más eficiente. Sin embargo, esto en muchas ocasiones no beneficia a las hembras, especialmente cuando el número de espermatozoides que confluye en el tracto femenino es muy elevado, lo que va a provocar un mayor riesgo de que un óvulo se fusione con más de un espermatozoide (polispermia). La polispermia es perjudicial para la hembra, ya que da lugar a embriones no viables que no se desarrollan; por tanto, se genera un escenario en el que las adaptaciones de los machos por incrementar su probabilidad de fecundar en respuesta a la competición espermática van a propiciar adaptaciones en la hembra para reducir la tasa de fecundación. Este fenómeno se conoce como conflicto sexual, ya que los intereses y las adecuaciones de cada sexo para incrementar su fitness reducen el del sexo opuesto (Hosken y Stockley, 2005; Chapman, 2006). Por otra parte, las hembras pueden imponer mecanismos para que sus ovocitos sean fecundados sólo por los espermatozoides de determinados machos, lo que se conoce como elección críptica (Eberhard, 1996; Gavrilets y col., 2001).

Debido a que el conocimiento de las bases moleculares del conflicto sexual y la elección críptica es limitado en virtud de la dificultad de estudiar las interacciones entre el eyaculado y el tracto reproductivo femenino in vivo (cfr. Pitnick y col., 2009; McDonough y col., 2016), la mayoría de los estudios tratando de ver las respuestas adaptativas ante la SSPC se han centrado en determinar el papel de la competición espermática en la evolución del eyaculado masculino (Birkhead y Moller, 1998; Pizarri y Parker, 2009).

5. El impacto de la selección sexual en la evolución de los genes reproductivos

De la sección anterior concluimos que las fuerzas de SSPC, y en concreto la competición espermática, juegan un papel importante en la adaptación de los rasgos reproductivos. No obstante, todas las adaptaciones fenotípicas deben ser el resultado de variaciones genéticas que se han fijado por selección positiva; por tanto, se establece que la SSPC va a dirigir primariamente cambios adaptativos en los genes reproductivos. Se han llevado a cabo diferentes aproximaciones para tratar de examinar los efectos de la variación en los sistemas de apareamiento sobre la evolución de los genes reproductivos, que van desde intentos por correlacionar la tasa evolutiva de las secuencias codificantes y reguladoras con la variación en la intensidad de la SSPC, hasta comparar los niveles de expresión de amplias colecciones de genes entre sexos y especies con diferentes sistemas de apareamiento. En las siguientes subsecciones describiremos brevemente cada una de las aproximaciones, comentando los principales hallazgos, así como las limitaciones de cada una de ellas.

5.1 Impacto sobre la evolución de las proteínas reproductivas

Los primeros trabajos que trataron de evaluar los efectos de la SSPC sobre la evolución de las proteínas reproductivas se basaron en la hipótesis de que la tasa evolutiva, o la intensidad de selección positiva, de un gen reproductivo debe incrementarse con los niveles de SSPC, los cuales se miden con un índice comportamental (ej. número de apareamientos por ciclo reproductivo) o anatómico (ej. tamaño relativo de testículos, que es un índice de competición espermática).

Para determinar la asociación entre la evolución de los genes reproductivos y los sistemas de apareamiento se han aplicado principalmente dos metodologías. La primera consiste en realizar un análisis de regresión lineal entre la tasa evolutiva () estimada para las ramas de una filogenia con un índice continuo de SSPC (fig. 3A); de este modo, la obtención de correlaciones significativas quiere decir que la proteína en cuestión evoluciona en respuesta a la selección sexual. Usando esta metodología, Dorus y colaboradores mostraron que la tasa evolutiva de la semenogelina 2 (SEMG2), que es el principal componente del fluido seminal y en la formación del coágulo seminífero en primates, se correlaciona positivamente con los niveles de competición espermática (Dorus y col., 2004). Además, ellos observaron que la tasa evolutiva de SEMG2 se relaciona con la tasa de coagulación del semen en diferentes especies de primates. Este trabajo representó la primera evidencia de una proteína reproductiva evolucionando bajo la influencia de la SSPC, además de demostrar el efecto de esta evolución a nivel fenotípico. Herlyn y Zischler (2007) analizaron la evolución molecular del gen zan que codifica para la zona adhesina, una proteína implicada en el reconocimiento gamético y en la fecundación; encontraron una correlación negativa entre y el nivel de dimorfismo sexual, que se interpreta como un índice inverso de competición espermática. Recientemente, Vicens y colaboradores examinamos la evolución molecular de PKDREJ, una proteína que participa en el transporte y la reacción acrosomal, y encontramos una correlación positiva entre la tasa evolutiva y el tamaño relativo de testículo en especies de roedores (Vicens, Montoto, y col., 2015). Es posible que la SSPC no sólo dirija cambios en la composición de aminoácidos, sino que también podría favorecer la fijación de inserciones y deleciones. El potencial adaptativo de estos cambios se planteó tras observar que el tamaño de una proteína del fluido seminal (SVS II) y otra del espermatozoide (catsper1) se correlacionan significativamente con los niveles de competición espermática (Ramm y col., 2009; Vicens, Tourmente, y col., 2014).

Aunque la primera hipótesis implicaba que la tasa evolutiva de una proteína reproductiva debe correlacionarse positivamente con los niveles de competición espermática, Lüke, Vicens y colaboradores encontramos una correlación inversa entre la tasa evolutiva del precursor de la protamina 2 (PRM2) y el tamaño relativo de testículo en roedores (Lüke y col., 2011). Dado que PRM2 está codificada por un gen duplicado de PRM1, que es la protamina principal encargada de compactar la cromatina durante la espermiogénesis, el gen PRM2 podría presentar una función redundante y estar sujeto a relajación funcional. Un estudio posterior reveló que una mayor conservación de PRM2 se correlaciona con una mayor elongación de la cabeza del espermatozoide, un rasgo que lo hace más veloz y por tanto más competitivo (Lüke y col., 2014). A partir de estos hallazgos se ha sugerido que la selección sexual puede actuar conservando copias de genes específicos del espermatozoide para potenciar algunas funciones.
La segunda aproximación se centra en determinar si existe mayor intensidad de selección positiva en aquellos linajes con mayor SSPC. En este método se clasifican las ramas de una filogenia en dos categorías, en función de su valor del índice de SSPC (fig. 3B). A esta filogenia se le aplican diferentes modelos evolutivos de máxima verosimilitud, para evaluar si existe selección positiva en las ramas correspondientes a los linajes de alta SSPC respecto de las de baja (para una descripción más detallada del método, ver Ramm y col., 2008). Ramm y colaboradores encontraron evidencia de selección positiva en cinco de siete proteínas implicadas en la reproducción en roedores. De estas cinco, sólo SVS2 –que es un componente del fluido seminal involucrado en la formación del tapón copulatorio– mostró selección positiva en los linajes de mayor competición espermática empleando la metodología mencionada. Finn y Civetta (2010) analizaron la evolución de la familia de proteínas de membrana ADAMs que participan en la interacción con otras células o componentes extracelulares y encontraron señal de selección positiva concentrada en las especies de primates más poliándricas para tres ADAM expresadas en la superficie del espermatozoide. En el trabajo citado en el párrafo anterior de Vicens y colaboradores (Vicens, Montoto, y col., 2014) también se detectó evidencia de selección positiva en PKDREJ para las especies de roedores con mayores niveles de competición espermática.

Figura 3. Métodos comparativos para identificar genes reproductivos bajo la influencia de la selección sexual poscópula (SSPC). A) Estimación de tasas evolutivas () en las ramas terminales de una filogenia y correlación de con un índice de SSPC como, por ejemplo, el tamaño relativo de testículo. La longitud de las ramas es proporcional a las tasas evolutivas. B) División de las ramas entre linajes con alta SSPC (ejemplo: especies poliándricas) o baja SSPC (ejemplo: especies monógamas). Modelos evolutivos de máxima verosimilitud que asumen selección purificante sobre todas las ramas (1, nulo) con modelos que tienen en cuenta selección positiva en las ramas de alta SSPC (> 1, alternativo) son comparados estadísticamente. Figura basada en Wong, 2011.

En la Tabla 1 se concentran todas las proteínas en las que se ha identificado un efecto de la SSPC. A pesar de que se ha analizado la evolución de numerosos genes reproductivos, han sido muy pocos en los que se ha encontrado una asociación significativa entre su tasa evolutiva (o su señal de selección positiva) y los niveles de SSPC. La dificultad para determinar el impacto molecular de la SSPC por estas metodologías se ha atribuido a cuatro posibles (y no excluyentes) factores: 1) los rasgos reproductivos normalmente están regulados por múltiples genes con efectos aditivos, 2) las fuerzas de selección sexual pueden actuar sobre diferentes genes en distintas especies, 3) otras fuerzas selectivas no relacionadas con el sexo (ej. respuestas inmunológicas en el tracto femenino) pueden dirigir la evolución de genes reproductivos y 4) los métodos para detectar covarianzas entre la tasa evolutiva de una proteína reproductiva y los sistemas de apareamiento presentan limitaciones importantes (Wong, 2011). Las dos primeras limitaciones pueden resolverse llevando a cabo análisis masivos que determinen la evolución de amplios catálogos de genes y proteínas entre especies con diferente sistema de apareamiento, como veremos a continuación.

Tabla 1. Lista de proteínas reproductivas masculinas que han evolucionado en respuesta a la selección sexual poscópula.

* Método comparativo para evaluar la asociación de evolución de genes con sistemas de apareamiento: correlación tasa evolutiva (Cor), clasificación de ramas por categorías en términos del nivel de selección sexual (Cat).

5.2 Impacto sobre la evolución de la expresión de los genes reproductivos

Las adaptaciones fenotípicas pueden ser resultado de cambios en la secuencia codificante de los genes; no obstante, las modificaciones en la regulación de la expresión génica pueden tener un efecto más importante en los cambios adaptativos, ya que las secuencias reguladoras y los niveles de expresión son más lábiles y presentan menos restricciones funcionales que las secuencias codificantes. Mientras que en la mayoría de los estudios en la pasada década se examinó la evolución estructural de las proteínas reproductivas, muy pocos trabajos se interesaron en evaluar los efectos fenotípicos de los cambios en las regiones reguladoras y los niveles de expresión de los genes reproductivos. Esto se ha debido principalmente a la mayor dificultad de identificar los elementos reguladores y a las limitaciones de los modelos que determinan el modo de evolución de la expresión génica (Gilad y col., 2006). No obstante, existen evidencias de que mutaciones adaptativas en los elementos reguladores pueden causar cambios en los niveles de expresión de los genes y que tal variación tiene la capacidad de generar modificaciones en rasgos fenotípicos (Sucena y Stern, 2000; Shapiro y col., 2004; Rockman y col., 2005).

Se ha demostrado que los genes con expresión sesgada entre los sexos son altamente divergentes, tanto a nivel de estructura como de expresión (Ellegren y Parsch, 2007). Por otra parte, un estudio de Brawand y colaboradores analizó la evolución de la expresión génica en diversos tejidos de mamíferos, evidenciando que en testículo ha sido mucho más rápida que en los tejidos somáticos (Brawand y col., 2011). Estas características han llevado a plantear que la rápida evolución de los genes con expresión restringida a los sexos masculino o femenino son producto de la selección sexual, aunque esto no se ha evaluado hasta recientemente. En un primer intento de determinar si la SSPC influye en la evolución de la expresión de los genes reproductivos masculinos, Martín-Coello y colaboradores (2009) compararon la secuencia reguladora de los genes que codifican para las protaminas entre especies de roedores con diferentes niveles de competición espermática. Ellos encontraron que la divergencia del promotor de PRM2 se correlaciona positivamente con los niveles de competición espermática. Posteriormente, Lüke y colaboradores (2014) detectaron una asociación negativa entre los niveles de transcripción de PRM2 y la elongación de la cabeza. Dado que una cabeza más elongada incrementa la velocidad de nado de los espermatozoides, es posible que la SSPC favorezca una menor expresión de PRM2 en las especies más promiscuas para generar espermatozoides más veloces y competitivos. Esto sugiere que las fuerzas de SSPC podrían dirigir cambios reguladores en la expresión de los genes reproductivos.

En un estudio reciente de Harrison y colaboradores (2015) se comparó la evolución del transcriptoma entre especies de aves con diferentes niveles de selección sexual, el cual reveló que los índices de SSPC predicen la proporción de genes que tienen una expresión restringida a los machos, fenómeno que no se observa en las hembras. En este estudio también se observó que los genes restringidos a machos presentan una mayor divergencia de sus secuencias codificantes. Sin embargo, no se encontró una asociación entre la tasa evolutiva de las secuencias codificantes con los niveles de selección sexual. Estos resultados sugieren que la selección sexual tiene, al menos a corto plazo, una mayor influencia sobre la evolución de la expresión de los genes que sobre la divergencia de las secuencias codificantes.

Se han propuesto varias fuerzas y mecanismos que podrían contribuir a la expresión sesgada de genes entre los sexos (Parsch y Ellegren, 2013). En el caso de los genes sesgados a los machos, un mecanismo propuesto y del cual se tiene cada vez más evidencias, es la adquisición de una expresión específica o enriquecida en el testículo de una nueva copia de un gen originada por un evento de duplicación en tándem o retroduplicación (Karr y Dorus, 2012; Parsch y Ellegren, 2013). Ésta puede ser la causa principal de que la evolución de la expresión en testículos sea mucho más rápida que en tejidos somáticos (Brawand y col., 2011). La adquisición de expresión de genes en el testículo puede dar lugar a la ganancia de nuevas proteínas y funciones en el espermatozoide, como se ha observado previamente en algunos estudios (Dorus y col., 2008; Dorus y col., 2011).

6. La proteómica comparativa como herramienta para estudiar el impacto de la selección sexual en el espermatozoide

Como dijimos en las secciones anteriores, las fuerzas de SSPC han tenido un fuerte impacto en la evolución de la expresión génica en los machos (ver subsección 5.2). Aunque el transcriptoma del testículo parece ser un foco de acción de la selección sexual, la evolución de la expresión génica en este tejido podría no mostrar una correlación clara con la diversificación del espermatozoide, dada la alta complejidad de los procesos de regulación que ocurren en la espermatogénesis (ver sección 2).

Los análisis proteómicos parecen ser, por tanto, una herramienta adecuada para asociar los cambios de expresión génica del testículo con la diversificación fenotípica del espermatozoide. A pesar de la amplia colección de estudios que ha caracterizado la composición del espermatozoide en diversas especies (ver sección 2), hasta recientemente no se han podido evaluar las bases moleculares de la diversificación del gameto masculino. Esto se ha debido principalmente a la carencia de herramientas cuantitativas que permitan comparar el proteoma de especies con diferentes sistemas de apareamiento. En un estudio actual llevado a cabo por Vicens y colaboradores, aplicamos por primera vez herramientas de proteómica cuantitativa para comparar el proteoma del espermatozoide entre tres especies de roedores con diferentes niveles de competición espermática (Mus musculus, M. spretus y M. spicilegus) (Vicens y col., 2017). En este trabajo se compararon cuantitativamente más de mil proteínas y se exploraron aquellas del espermatozoide que muestran patrones de divergencia correlacionados con cambios en la intensidad de competición espermática mediante análisis de clustering (fig. 4A). Exámenes de ontología sobre las proteínas de cada clúster revelaron grupos subcelulares y funcionales que responden a la variación en la competición espermática; un hallazgo interesante fue el enriquecimiento de proteínas acrosomales y del complejo receptor de la zona pelúcida dentro del clúster 2 (fig. 4B), indicando que la especie que experimentó una relajación de la selección sexual desde el ancestro común (M. musculus) redujo la expresión de proteínas implicadas en el reconocimiento e interacción con la zona pelúcida. Esto podría justificar las asimetrías en fecundación que se observaron previamente entre estas especies (Martin-Coello y col., 2009). Respecto del flagelo, se percibió un enriquecimiento de proteínas que componen el armazón de dineínas y el aparato central del axonema, así como un grupo de proteínas que contribuyen a la actividad motriz de los microtúbulos, en los clústers 1 y 2, correlacionados positivamente con los niveles de competición espermática (fig. 4B). Por otra parte, en los clústers 3 y 4, que corresponden a una disminución de la abundancia en especies de mayor competición espermática, se registró una alta representación de proteínas implicadas en glicolísis (fig. 4C). Esta observación reflejaría la menor dependencia que tienen las especies M. spretus y M. spicilegus de esta ruta metabólica para la producción de ATP (Tourmente y col., 2015).

Figura 4. Diversidad del proteoma del espermatozoide asociada con la intensidad de competición espermática. A) Análisis de clustering identificaron patrones de divergencia asociados con los niveles de competición espermática, estimada con la diferencia en el tamaño relativo de testículos. La significancia de pertenencia de las proteínas a cada clúster se indica mediante colores (morado: mayor probabilidad; verde: menor probabilidad), así como el porcentaje de desviación en la cantidad de proteínas asociadas a cada clúster respecto de la esperada desde una distribución uniforme (60 proteínas por clúster).

Figura 4B&C. Enriquecimiento de proteínas pertenecientes a diferentes grupos funcionales relacionados con la cabeza (B) y el flagelo (C) Diferencias significativas entre clusters se señalan con asteriscos. Los valores de enriquecimiento se estimaron con base en la frecuencia de proteínas esperada, dentro de categoría del proteoma del espermatozoide. Figuras tomadas y modificadas de Vicens y col., 2017.

Por tanto, nuestros análisis de proteómica comparativa sugieren que algunos grupos de proteínas podrían alterar su nivel de abundancia en el espermatozoide como respuesta primaria a un aumento o reducción de la competición espermática. No obstante, queremos ser cautos a la hora de interpretar nuestros resultados, ya que sólo trabajamos con tres especies. Además, se debe tener en cuenta que la competición espermática probablemente no es la única fuerza que provoca la variación proteómica observada y que otros procesos neutrales o selectivos deben ser considerados para comprender mejor la diversificación molecular del espermatozoide.

7. Futuras perspectivas

Los avances en las herramientas de genómica y proteómica logrados durante la última década han permitido ampliar el conocimiento sobre la composición molecular de los diferentes tejidos reproductivos y del espermatozoide. Empero, el estudio de las fuerzas y mecanismos que dirigen la evolución de los genes reproductivos todavía se encuentra en una etapa temprana. Las primeras indagaciones que integran métodos masivos con análisis de genómica comparativa y evolución molecular han permitido conocer el impacto de la selección positiva sobre el proteoma de tejidos reproductivos y el espermatozoide; sin embargo, la evolución adaptativa de los genes reproductivos parece ser resultado de fuerzas selectivas heterogéneas y entre éstas el grado de aportación de la selección sexual aún no se ha determinado. Por tanto, para evaluar rigurosamente el impacto de las fuerzas de SSPC sobre la evolución de sistemas reproductivos y los gametos se requieren aproximaciones que comparen catálogos amplios de genes o proteínas entre especies filogenéticamente próximas que abarquen un rango de sistemas de apareamiento. Empero, siempre se debe tener en cuenta que pueden existir fuerzas selectivas más prominentes que la selección sexual y otras funciones pueden ser el resultado de la evolución adaptativa de los genes reproductivos como, por ejemplo, la respuesta inmune.

Por otro lado, la inmensa mayoría de estudios que han analizado el papel de la selección sexual en rasgos reproductivos se han centrado únicamente en componentes masculinos, dejando de lado los femeninos. Futuros análisis evolutivos y funcionales de los sistemas reproductivos deberán tener en cuenta la interacción y el conflicto entre los dos sexos; es decir, para tener un conocimiento más preciso sobre la influencia de las fuerzas de SSPC se deberá estudiar conjuntamente el espermatozoide con elementos del tracto reproductivo femenino (TRF). Considerar las interacciones entre los componentes masculinos y femeninos también será necesario para comprender cómo coevolucionan los sistemas reproductivos.

Aunque tradicionalmente se han utilizado aproximaciones de genética inversa para investigar las bases moleculares de los rasgos reproductivos adaptativos, las herramientas de genética directa pueden ser muy valiosas para identificar genes asociados con diferencias en el éxito reproductivo. Un buen ejemplo es el reciente trabajo de Fisher y colaboradores (2016), quienes identificaron que la variación del locus PRKAR1A predice diferencias en la longitud de la pieza media del espermatozoide y la eficiencia de fecundación.