El papel del glutatión reducido (GSH) en el proceso de capacitación espermática

1. Introducción

La última pieza de la reproducción sexual es la fusión entre los gametos masculino y femenino para la generación de un nuevo individuo, lo que involucra procesos orquestados por el sistema neuroendocrino y, en el caso particular del espermatozoide, la preparación para estar plenamente apto para la fertilización, que termina en el tracto reproductor femenino (O’Donnell y col., 2006).

La producción de gametos masculinos ocurre en el testículo, a través de un proceso conocido como espermatogénesis. Posteriormente ingresan al epidídimo para completar su maduración, mediante cambios estructurales y funcionales para que alcancen la capacitación y la reacción acrosomal (RA) en el tracto reproductor femenino y concluir con la fertilización (O’Donnell y col., 2006; Cunningham y Klein, 2003).

Después de que los espermatozoides recorrieron el caput y el corpus del epidídimo, se almacenan en la cauda, antes de ser eyaculados. Se ha reportado que el tránsito por el epidídimo del cerdo es de aproximadamente nueve días (Shalender Bhasin, 2006; Franca y Cardoso, 1998). La eyaculación es provocada por el sistema nervioso central, promoviendo que las fibras musculares que rodean al epidídimo expulsen a los espermatozoides por el conducto deferente hacia la uretra, junto con las secreciones de las glándulas sexuales accesorias, formando el semen (Shalender Bhasin, 2006).

Los espermatozoides tienen que pasar por la capacitación y la RA previo a poder fertilizar al óvulo. En humanos, este proceso parece estar regulado, en parte, por reacciones de óxido-reducción (De Lamirande y Gagnon, 1998; De Lamirande y Gagnon, 2003) donde participan las especies reactivas del oxígeno (ERO). Los espermatozoides, al igual que otras células en condiciones aeróbicas, son capaces de producir ERO, que pueden ser nocivas para ellos mismos, provocando daños en la membrana y el ADN, además de afectar la movilidad y viabilidad espermática (Gagnon y De Lamirande, 2006; Medeiros, 2008). Sin embargo, existe evidencia que indica que la generación de las ERO (fig. 1) está implicada en la adquisición de la capacidad fertilizante de los espermatozoides (De Lamirande y Gagnon, 1998; De Lamirande y Gagnon, 2003). Se ha reportado que la generación de cantidades controladas de ERO, tales como el anión superóxido (O2-) y su producto de dismutación, el peróxido de hidrógeno (H2O2), participan en la regulación y funciones fisiológicas de los espermatozoides (De Lamirande y Gagnon, 1998; De Lamirande y Gagnon, 2003).

Figura 1. Esquema del ciclo REDOX en la regulación de las ERO (Aitken y Roman, 2008).

Si bien en estudios iniciales no se establece claramente la relación directa entre las ERO y los espermatozoides (Aitken y col., 2016), existen algunas evidencias de su asociación; MacLeod (1943) reportó en espermatozoides humanos pérdida de la movilidad debido a concentraciones de oxígeno altas, implicando directamente al H2O2 en esta alteración. Por otra parte Tosic y Walton (1946), estudiando espermatozoides de toro, encontraron que el H2O2 alteró la función espermática a nivel de la respiración celular; posteriormente, Evans (1947) y sus colaboradores reportaron que la función principal del espermatozoide de erizo de mar puede verse afectada por estrés oxidante. De igual forma, Aitken y su grupo (1993) reportaron que la enzima catalasa –y no la superóxido dismutasa– era capaz de inhibir el efecto deletéreo de las ERO, particularmente del H2O2. Hoy en día los estudios continúan demostrando que el estrés oxidante puede afectar procesos fisiológicos en el espermatozoide, como inhibir la capacitación y la movilidad (Morielli y O’Flaherty, 2015).

Los daños mencionados se presentaron en espermatozoides eyaculados, no obstante, también existen estudios en donde se reporta daño producido por ERO en la maduración espermática epididimaria. En 2017, Liu y O’Flaherty encontraron en la cauda del epidídimo de rata espermatozoides con una movilidad baja y ADN oxidado cuando se presentó estrés oxidante generado por un hidroperóxido (tert-BHP). En este sentido, también reportaron un aumento en la expresión de otra enzima antioxidante, la peroxirredoxina (PRDX) en la cauda del epidídimo, lo que demuestra que el epidídimo defiende al espermatozoide frente al estrés oxidante (Liu y O’Flaherty, 2017). Respecto de lo anterior, se ha descrito que los espermatozoides de humano, al igual que los de cerdo, tienen la característica de presentar niveles altos de ácidos grasos poliinsaturados (PUFA), estas insaturaciones los hacen muy vulnerables a los radicales libres, generando peróxidos lipídicos y aldehídos, provocando como consecuencia directa la inhibición de la movilidad espermática y comprometiendo de esta forma la capacidad fertilizante del espermatozoide (Jones y col., 1979; Roca y col., 2005; Malo y col., 2010). Por otro lado, las ERO participan en la fisiología del espermatozoide, particularmente durante la capacitación espermática, donde se han asociado con el incremento de la fosforilación de residuos de tirosina, estimulando directamente a las enzimas tirosina cinasa (TK) y adenilato ciclasa soluble (ACs) e inhibiendo a la fosfatasa de tirosina (TP) (Ford, 2004).

2. Capacitación espermática

La capacitación espermática es esencial para garantizar la fertilización del ovocito, es un proceso sumamente complejo que ocurre durante el tránsito del espermatozoide por el tracto reproductor femenino (fig. 2) (O’Flaherty, 2015; López Úbeda y Matas Parra, 2015). En este recorrido, el espermatozoide sufre cambios bioquímicos, membranales, en el metabolismo energético, así como en actividad enzimática (De Lamirande y Gagnon, 1998), cambios que sólo ocurren cuando previamente se ha llevado a cabo satisfactoriamente la espermatogénesis (en el testículo) y la maduración espermática epididimaria (Cervantes y col., 2008).

Figura 2. A) Después de la eyaculación, una población heterogénea de espermatozoides alcanza el tracto reproductivo femenino. B) Sólo unos cuantos logran llegar al oviducto. C) Sólo el espermatozoide capacitado correctamente puede fertilizar al ovocito. Espermatozoide muerto (gris), dañado (rojo), normal (azul), hiperactivado (verde-azul) y capacitado (verde) (López Úbeda y Matas Parra, 2015).

De las modificaciones que sufre la membrana plasmática destaca el reordenamiento de proteínas y lípidos, entre los que el flujo de salida de colesterol es uno de los más importantes, modulado por las secreciones del tracto reproductor femenino, que tienen una concentración de albúmina alta que adsorbe el colesterol, lo que le da fluidez a la membrana, activando los canales de bicarbonato y, posteriormente, de calcio (Vadnais y Althouse, 2011). El incremento en la concentración de estos iones en el citoplasma del espermatozoide estimula a la adenilato-ciclasa, que comienza a producir AMPc a partir de ATP. Esta producción activa a proteínas cinasas dependientes de AMPc (proteína cinasas A; PKA) (Cross, 2004), con lo cual la membrana plasmática y la membrana externa del acrosoma adquieren la capacidad de fusionarse una con otra al ser modificada su fluidez y su permeabilidad (Gadella, 2008). El resultado final de esta remodelación permite que el espermatozoide sea capaz de unirse a la zona pelúcida del óvulo y que lleve a cabo la reacción acrosomal (Rosado, 1988; Gadella, 2008).

2.1 Hiperactivación espermática

Uno de los cambios fisiológicos del espermatozoide capacitado es la hiperactivación. Esto es, su movimiento flagelar cambia de una movilidad progresiva a un mayor movimiento y flexión del flagelo, gran amplitud del desplazamiento lateral de la cabeza, así como una trayectoria irregular y tortuosa (Gagnon y De Lamirande, 2006). El motivo de la hiperactivación es que el espermatozoide debe tener el vigor suficiente para penetrar la capa de células de la granulosa y la zona pelúcida del ovocito, así como poder desplazarse en el fluido del tracto reproductor femenino, hasta que su membrana toque a la del óvulo (Tulsiani, 2006). Para esto, los espermatozoides mantienen gradientes iónicos precisos a través de su membrana plasmática, mismos que son regulados por ATPasas dependientes de Na+/K+ y Ca2+; así, la alteración en la concentración iónica activa enzimas del acrosoma y enzimas relacionadas con los cambios en la movilidad (Gadella, 2008).

La inducción de la hiperactivación requiere Ca2+ intracelular e incremento del AMPc y del pH intracelular. La hiperactivación del espermatozoide se debe a que el Ca2+ se une a proteínas fijadoras en el brazo externo de la dineína, la cual se encuentra en la parte interna del flagelo (Inaba, 2003). La dineína es responsable de la conversión de energía química a partir de la hidrólisis de ATP, generando la energía mecánica necesaria para la movilidad (Gagnon y De Lamirande, 2006). El Ca2+ puede provenir de varios lugares, como reservas intracelulares mediadas por los receptores de inositol 1,4,5-trifosfato (IP3) o la mitocondria y de manera extracelular por sistemas de transporte Na+/H+ y Na+/Ca2+ (Gadella, 2008). La remoción del colesterol de la membrana plasmática del espermatozoide también puede activar directamente canales iónicos, aumentado la concentración de Ca+2 intracelular (Darszon y col., 2011).

De igual forma, se ha descrito la posible participación de un cotransportador de sodio y bicarbonato (NBC, por sus siglas en inglés, Na+/Bicarbonate Cotransporter), probablemente activado por el Ca+2 extracelular, que favorece la entrada de Na+ y HCO3-, donde este último resulta fundamental para la activación de la enzima ACs, que se encuentra soluble en el citosol; de esta manera aumenta la producción de AMPc (Darszon y col., 2011). Asimismo, se ha reportado un canal intercambiador sodio-protón (sNHE, por sus siglas en inglés, Na+/Hydrogen Exchanger) que funciona intercambiando Na+ y H+, y en conjunto con un canal específico de protones (Hv) regulado por Zn+2, elevan el pH intracelular (de 6.0 a 7.5), relevante para que se puedan activar canales iónicos (Ca+2, Cl- y K+) favoreciendo la hiperactivación. Al mismo tiempo, el aumento en los niveles de AMPc activa a la PKA, estimulando la TK (Proteína Tirosina Cinasa), y éstas a su vez la fosforilación de tirosinas, proceso que se asocia con la capacitación espermática (Darszon y col., 2011).

3. Glutatión

Las enzimas antioxidantes superóxido dismutasa (SOD), catalasa (CAT) y glutatión peroxidasa (GPX) son las encargadas de proteger al espermatozoide contra el estrés oxidante. Particularmente la GPX es responsable de metabolizar el peróxido de hidrógeno (H2O2) producido de manera endógena, usando como sustrato al glutatión reducido (GSH), que es oxidado a glutatión disulfuro (GSSG) y puede volver a su estado reducido por acción de la enzima glutatión reductasa (GR) para que nuevamente tenga actividad antioxidante, proceso conocido como ciclo redox del glutatión (Martínez- Sámano, 2011).

Ahora bien, desde el punto de vista químico, el GSH es un compuesto de masa molecular baja, con un grupo sulfhidrilo (-SH), conformado por los aminoácidos ácido glutámico, glicina y cisteína (Glu-Gly-Cys) (fig. 3), también llamado Lγ-glutamil-cisteinil-glicina; su fórmula molecular es C10H17N3O6S2 y su peso molecular es 307.33 g/mol. El glutatión oxidado es el L γ-glutamil-L-cisteinil-glicina disulfuro (GSSG) y su fórmula molecular es C20H32N6O12S2 (Sarrasague y col., 2006).

Figura 3. Representación del A) glutatión reducido (GSH) y B) glutatión disulfuro (oxidado, GSSG) (Martínez-Sámano, 2011).

La concentración de glutatión intracelular se encuentra en el intervalo de 1 a 11 mM en células somáticas de mamíferos (García-Giménez y col., 2013; Lu, 2013); estudios más especializados han reportado una concentración de GSH en espermatozoides de cerdo, de 3.84 ± 0.21 nM/108, y en espermatozoides de humano, 4.47 ± 0.46 nM/108 (Gadea y col., 2004; Gadea y col., 2011). Del mismo modo, se ha informado que la concentración citosólica de GSH en células somáticas de mamíferos representa entre 70 y 85%, mientras que la concentración nuclear y mitocondrial representan entre el 15 y 30% restante, además se ha reportado un pequeño porcentaje en retículo endoplásmico (García-Giménez y col., 2013; Lu, 2013). El GSH también tiene funciones importantes en la destoxificación de xenobióticos y sirve para almacenar y transportar cisteína (Martínez-Sámano, 2011). Por otro lado, es esencial para la proliferación celular y ostenta un papel relevante en la inhibición de la apoptosis, ya que su disminución permite la activación de caspasas y la progresión de la apoptosis. Otra de sus funciones es mantener el potencial de óxido-reducción de la célula, ya que conserva en estado reducido los grupos tiol de las proteínas y así permite la generación de varias cascadas de señalización intracelular; un ejemplo de esto es la de las PKC y PKA (Martínez-Sámano, 2011).

El GSH se sintetiza en el citoplasma de las células por la acción consecutiva de dos enzimas: γ-glutamil-cisteína (γ-GluCys) y sintetasa (también conocida como glutamato cisteína ligasa, GCL por sus siglas en inglés), que utiliza glutamato y cisteína como sustrato para formar el dipéptido γ-glutamilcisteína. Esta enzima es considerada como el paso limitante en la síntesis de glutatión; posteriormente la glicina, en una reacción catalizada por la glutatión sintetasa, forma GSH. El ATP es donador de energía para ambas reacciones. La concentración intracelular de GSH es regulada por la inhibición de la GCL por el producto final, GSH. Así, existe un equilibrio celular entre la síntesis y el consumo (fig. 4) (Sarrasague y col., 2006; Martínez-Sámano, 2011; Lu, 2013).

Figura 4. Esquema representativo de la síntesis de glutatión (modificado de Martínez- Sámano, 2011; Lu, 2013).

3.1 Metabolismo del glutatión

Durante la destoxificación de las ERO, el GSH está involucrado en dos tipos de reacciones: la interacción no enzimática con radicales como el O2-, óxido nítrico y OH•; otra reacción en la que participa es proporcionando un electrón para reducir peróxidos en la reacción catalizada por la GPx (Fernández-Checa, 2008). El producto final de la oxidación del GSH es el GSSG, regenerado por la GR, que transfiere electrones del NADPH al GSSG, reduciéndose a NADP+. Durante las reacciones catalizadas por la GPx y la GR, el GSH no es degradado, sino reciclado, y así puede reutilizarse (Martínez-Sámano, 2011; Ralf y col., 2000).

Por otro lado, durante la generación de conjugados S-glutatión por las glutatión S-transferasas (GST) o por la salida de GSH de las células, el nivel interno de GSH disminuye, de ahí que tenga que ser reemplazado por síntesis de novo (Dringen y col., 2000). Entonces, el GSH extracelular y los conjugados S-glutatión son sustratos para la enzima γ-glutamil transpeptidasa γ-GT), la cual cataliza la transferencia del γ-glutamilo del GSH (o de los conjugados S-glutatión) a una molécula aceptora y, por ende, genera el dipéptido cisteinilglicina (o el conjugado S-cisteinilglicina) y el γ-glutamilo conjugado. El dipéptido cisteinilglicina puede ser hidrolizado por ectopeptidasas de cisteína y glicina, aminoácidos que posteriormente pueden ser transportados por la célula a través de transportadores específicos y participar en la síntesis de novo de GSH (Ralf y col., 2000).

Ahora bien, cuando las células espermáticas son liberadas del testículo, su núcleo está sumamente empaquetado para realizar actividad transcripcional; no obstante, presentan cambios durante su paso por el epidídimo (maduración espermática epididimaria), por el tracto reproductor femenino (capacitación) y en el momento previo a la fertilización (reacción del acrosoma) (Halliwell, 2006). Es posible lograr estos cambios por modificaciones en las proteínas existentes que, a su vez, podrían ser moduladas por señales originadas desde los diferentes ambientes espermáticos; de esta manera, la fisiología de los espermatozoides dependerá de redes de señales intra y extracelulares complejas (Halliwell, 2006).

Una de las señales extracelulares que más se conoce es la participación de citocinas, hormonas y neurotransmisores que se unen a receptores específicos de la superficie celular, mismas que al juntarse con sus receptores pueden generar varios tipos de señales intracelulares, como cambios en la concentración de iones, activación de proteínas G, como GMPc, y activación de cinasas PKA y PKC. Estas modificaciones, a su vez, provocarán la liberación de segundos mensajeros: AMPc, Ca2+ y metabolitos de fosfolípidos y la fosforilación de proteínas, procesos que resultan esenciales para las funciones celulares, en el caso del espermatozoide para adquirir su capacidad fertilizante (Cisneros-Mejorado y col., 2014; Darszon y col., 2011).

Ya que las ERO intervienen en el desempeño espermático durante su tránsito desde el testículo hasta el ovocito y son producidas por los mismos espermatozoides, los antioxidantes –entre los que se encuentra GSH/GPX– pueden retrasar o inhibir la oxidación, por lo tanto, pudieran funcionar como reguladores de la capacitación (Rodwell, 2007).

Se ha observado que las ERO participan en la fosforilación de tirosinas, influyendo directamente en los niveles intracelulares del AMPc, gracias a la estimulación de la adenilato ciclasa (ACs) y por consecuencia, la fosforilación de proteínas (Rivlin y col., 2004). Además de que el H2O2 puede aumentar la fosforilación de tirosina a través de la inhibición de la actividad de la TP (Hecht y Zick, 1992).

4. Aplicaciones prácticas del GSH

El GSH se ha usado comúnmente para mejorar la calidad espermática de varias especies, sobre todo en espermatozoides congelados, usando concentraciones variables del mismo (Gadea y col., 2005). Sin embargo, el impacto positivo de las ERO se ha determinado agregando moléculas que contrarresten su producción o su efecto, como algunos antioxidantes (Gadea y col., 2005). Un ejemplo de lo anterior es lo reportado por Gadea y colaboradores en 2005, quienes encontraron que el GSH puede propiciar un resultado contraproducente en la capacitación espermática cuando se agrega en una concentración de 5mM sobre los espermatozoides de cerdo, ya que disminuyen los espermatozoides viables capacitados respecto del control, y a 1 mM; en contraste, se incrementan los espermatozoides que penetran al ovocito, a 1 mM de GSH la movilidad es mejor que a 5 y 10 mM (Gadea y col., 2005; Zhang y col., 2016). Por otro lado, en humanos y en cerdos la concentración basal de GSH disminuye en espermatozoides congelados respecto de espermatozoides frescos (Gadea y col., 2004; Gadea y col., 2011).

Estudios recientes han demostrado que no sólo el espermatozoide de cerdo sufre daño al congelar-descongelar; Lucio et al. (2016) reportaron en espermatozoides descongelados de perro, mediante el estudio CASA (por sus siglas en inglés, Computer Assisted Sperm Análisis), una reducción en la movilidad progresiva total y en la actividad mitocondrial de espermatozoides tratados con 20 mM de GSH, comparándolos con el control sin GSH (Lucio y col., 2016).

Acerca de lo anterior, es evidente que la concentración de GSH resulta fundamental para mantener un equilibrio redox en el espermatozoide, no únicamente en especies domésticas como el cerdo o el perro; en 2017, Angrimani y colaboradores reportaron en espermatozoides de Leopardus tigrinus una disminución en la actividad mitocondrial dependiente de la concentración de GSH, fenómeno que pudiera ser resultado de la inhibición de las ERO por las altas concentraciones de este antioxidante, bloqueando así la actividad fisiológica que tienen las ERO en el espermatozoide (Angrimani y col., 2017).

Una muestra de la versatilidad del GSH es su uso en diferentes técnicas, no únicamente para espermatozoides congelados-descongelados o evaluación de su actividad en procesos como capacitación espermática, lo que fue demostrado por Zambrano et al. (2017), quienes dijeron haber utilizado GSH a concentración de 15 mmol/L en combinación con medios de pre-tratamiento para ICSI (por sus siglas en inglés, Intracytoplasmic Sperm Injection), encontrando una mejora en la descondensación de la cromatina del espermatozoide de toro, en comparación con tratamientos sin GSH (Zambrano y col., 2017).

El sistema antioxidante enzimático y no enzimático del espermatozoide es muy importante para su maduración, primero en el testículo, después en el epidídimo y por último en el tracto reproductor de la hembra; por lo tanto, el GSH participa en la regulación de estos procesos, aunque su mecanismo de acción no ha sido completamente descrito.

5. Conclusiones

El proceso de capacitación espermática resulta fundamental para que el espermatozoide cumpla con su función principal: la de fertilizar al óvulo; sin embargo, dicho proceso está regulado por varios factores, entre los que destacan la participación de las ERO. La oxidación que sufre el espermatozoide debe estar controlada para que no sea contraproducente en su fisiología; tal regulación está dada, entre otras variables, por el GSH, ya que en conjunto con el sistema antioxidante enzimático proporciona el ambiente redox adecuado para que el espermatozoide adquiera su capacidad fertilizante.