Comparación de la conservación in vitro y capacidad fertilizante in vivo del semen de conejo refrigerado con dos diluyentes

1. Introducción

En México, la actividad cunícola ha tenido un desarrollo limitado (Torres, 2012). En 2001, la Secretaría de Agricultura, Ganadería, Desarrollo Rural, Pesca y Alimentación (Sagarpa) reconoció de manera oficial a la cunicultura como actividad ganadera y el Sistema Nacional de Información inició el registro estadístico de esta ocupación productiva. La investigación en la cunicultura ha sido escasa en el país y se ha realizado de manera desarticulada y dispersa; además de no aprovechar los beneficios biológico-económicos que ofrece la especie, como elevada prolificidad, ciclo reproductivo corto y amplio grado de diversidad genética (Lavara y col.,2003). Por tanto, la inseminación artificial (IA) ofrece ventajas de manejo, ya que permite sincronizar partos de un gran número de animales usando un mínimo número de sementales, disminuye el riesgo de propagación de enfermedades y permite la utilización de semen refrigerado (Bilbao, 1996). Uno de los factores más importantes involucrados en la IA es el medio en el que se diluye el semen (Castellini, 1996), el cual permitirá mantener una mayor proporción de espermatozoides vivos hasta el momento de la inseminación (Vega y col.,2012). A diferencia de otras especies, los espermatozoides de conejo presentan una baja permeabilidad al agua y un alto coeficiente de activación de energía, razones por las cuales la supervivencia espermática resulta inferior al utilizar técnicas como la criopreservación. Por tanto, la conservación de semen de conejo mediante refrigeración constituye una estrategia oportuna para alargar la vitalidad espermática, reduciendo la alteración de la funcionalidad y pérdida de la vitalidad al ser sometidos al proceso congelación/descongelación. Por ello, el objetivo de este trabajo fue evaluar el efecto de dos diluyentes para la refrigeración (5 °C) seminal durante 24 horas sobre la calidad espermática del conejo y los parámetros de fertilidad y prolificidad de las hembras inseminadas artificialmente con el semen refrigerado.

2. Material y métodos

Se utilizaron conejos blancos de raza Nueva Zelanda. Para obtener los eyaculados se utilizó una vagina artificial (VA) tipo francés, a una temperatura de 45 °C (Lavara y col.,2013). Posteriormente se trasladó en un termo a una temperatura de 38 ºC al Laboratorio de Biología de la Reproducción de la Universidad Autónoma Metropolitana-Iztapalapa.

2.1 Evaluación seminal

Las muestras fueron colocadas en baño María (38 °C). Se evalúo la movilidad masal usando una escala de 0 a 5, donde 0 indica ausencia de movimiento y 5 ondas espermáticas rápidas apreciables. Para ello, se colocaron 5 μl de muestra en un portaobjetos y se analizó bajo el microscopio óptico con objetivo 10X. Para la movilidad progresiva se colocaron 5 μl de muestra en un portaobjetos y se colocó un cubreobjetos, examinando con objetivo 20X, valorando el porcentaje de espermatozoides que mostraron movimiento progresivo. Para determinar el porcentaje de vitalidad y morfología se utilizó la tinción eosina-nigrosina, con la que los espermatozoides vivos no se tiñen y los muertos presentan coloración rosácea. En cuanto a la morfología, se categorizaron como normales o anormales cuando presentaron irregularidades de cabeza, pieza media y cola. La concentración espermática se calculó utilizando la cámara Neubauer, para ello se realizó una dilución de 995μl de agua destilada y 5μl de semen, colocando 15μl de la dilución en cada una de las secciones de la cámara y se evaluó al microscopio con objetivo 40X. El resultado se expresó en millones de espermatozoides por mL (X106/mL). Se revisó el estado del acrosoma, colocando 10 μl de la muestra espermática con medio Tris y 10 μl de preparación de Clortetraciclina (CTC), haciendo un extendido sobre un portaobjetos previamente temperado a 37 °C. Se observó la muestra con un aumento de 100X, y se le agregó una gota de aceite de inmersión para ayudar a un mejor enfoque. Por medio de la fluorescencia emitida por la CTC se determinaron los patrones y el estado acrosomal, donde: patrón F= espermatozoides no capacitados con acrosoma intacto, patrón B= espermatozoides capacitados con acrosoma intacto y patrón RA= espermatozoides capacitados con reacción acrosomal.

2.2 Procesamiento y evaluación de las muestras

El volumen de cada uno de los eyaculados se dividió en dos alícuotas, cada una se diluyó en una proporción 1:1 (semen/Tris, v/v) en Tris-yema de huevo (TY) y Tris-leche descremada (TL), utilizando tubos eppendorf de 1 mL. Inmediatamente después fueron puestas en refrigeración a 5 °C, durante 24 horas. La velocidad de enfriamiento desde la temperatura ambiente a 5 °C fue de 0.68 °C/ min. La determinación de movilidad progresiva, vitalidad y morfología se realizó a las dos, cuatro, seis, ocho, 12 y 24 horas post- refrigeración y la determinación del estado del acrosoma se llevó a cabo a las dos, ocho y 24 horas post-refrigeración para ambos diluyentes utilizados.

2.3 Inseminación artificial

Las hembras fueron expuestas a un cambio súbito de ambiente (cambio de jaula) ocho horas antes de la inseminación artificial, con el propósito de sincronizar el celo. Posteriormente se les colocó en un cañón (dispositivo de apoyo y sujeción), dentro del cual se les introduce dejando expuestos los miembros posteriores y el área genital para facilitar el procedimiento de inseminación (Alvariño, 2009). Se depositaron 0.5 ml por dosis de los medios utilizados (TY y TL) a diferentes tiempos post-refrigeración (dos, ocho y 24 horas, además del control). Inmediatamente después se aplicaron 25 UI de un análogo de GnRH para inducir la ovulación (Fertagyl®). El número de hembras inseminadas fue de cinco para cada uno de los medios y tiempos establecidos (n=35).

2.4 Análisis estadístico

Los parámetros de calidad espermática (movilidad progresiva, vitalidad, morfología normal e integridad acrosomal) se compararon entre tratamientos mediante un ANOVA, utilizando el paquete estadístico NCSS. Un valor de P menor de 0.05 (P < 0.05) se consideró significativo.

3. Resultados

De los eyaculados recolectados en fresco se obtuvo un volumen de 0.47 ± 0.21 ml, movilidad masal de categoría 4, movilidad progresiva de 85 ± 4%, vitalidad de 88 ± 5%, morfología normal de 71 ± 7.13% y una concentración de 283.81 ± 103.22 106/ml. Parámetros de movilidad progresiva, vitalidad y morfología normal hacia las 24 horas post-refrigeración con ambos diluyentes (cuadro 1). La integridad del acrosoma hacia las dos, ocho y 24 horas post-refrigeración se indican en el cuadro 2. En el cuadro 3 se muestra el comportamiento reproductivo en conejas inseminadas con semen fresco y semen refrigerado hacia las 24 horas, utilizando ambos diluyentes.

Tabla 1. Movilidad progresiva, vitalidad y morfología normal hacia las 24 horas post-refrigeración con los diluyentes TY y TL.

Tabla 2. Integridad del acrosoma hacia las 24 horas post-refrigeración con los diluyentes TY y TL.

Tabla 3. Efecto del tipo de preservación de semen y diluyente sobre parámetros reproductivos en conejas primíparas inseminadas artificialmente. TR= Tiempo de refrigeración. TY= Diluyente Tris + yema de huevo. TL= Tris + leche descremada. DG+= Diagnóstico de gestación positiva. F= Fertilidad. GNT= Gazapos nacidos totales. TPC= Tamaño promedio de camada. PPC= Peso promedio de camada.

4. Discusión

La movilidad, vitalidad, morfología e integridad de las membranas plasmática y acrosomal son parámetros de la función espermática directamente relacionados con la capacidad fertilizante y que se modifican con la refrigeración a largo plazo. En este trabajo logró observarse una disminución en la movilidad progresiva a partir de las 12 y hasta las 24 horas post-refrigeración entre diluyentes. Estudios previos han demostrado un efecto protector proporcionado por la yema de huevo sobre este parámetro en diversas especies (Crespilho y col.,2014; Allai y col.,2015; Sánchez y col.,2006). En relación con la vitalidad y morfología normal no se presentaron diferencias significativas (P>0.05) tanto en el tiempo de conservación como entre los diluyentes respecto del control. Rosato et al (2006) reportan 65% de vitalidad en espermatozoides refrigerados de conejo utilizando un diluyente comercial (Lepus) hacia las 24 horas de refrigeración, evidenciando un resultado inferior acerca de ambos diluyentes utilizados en este estudio (TY 79 ± 10.91% y TL 75.57 ± 11.87%). Este mismo comportamiento también se observó para el parámetro de morfología normal espermática. Los resultados obtenidos en este estudio con el diluyente TL fueron inferiores a los alcanzados con el diluyente TY. Pese a la amplia utilización de leche descremada de manera convencional como componente en la conservación de semen (Salamon y Maxwell, 2000), actualmente el mecanismo de acción por el cual este líquido ejerce un efecto protector no se ha esclarecido en su totalidad, aunque se han propuesto varios mecanismos (Bergeron y Manjunath 2006). Los resultados de integridad acrosomal en este trabajo reportan que para las ocho y 24 horas post-refrigeración los espermatozoides conservados con el diluyente TY registraron mayores porcentajes de integridad en su acrosoma (espermatozoides no capacitados con acrosoma intacto), mostrando 61.83% y 59.17%, respectivamente, en comparación con 56.17% (ocho horas) y 50.5% (24 horas) correspondientes al diluyente TL. No obstante, hacia las dos primeras horas post-refrigeración el comportamiento entre diluyentes se presentó sin cambios. Estos resultados se encuentran muy por encima de los obtenidos por Crespilho y col., (2014), quienes reportaron 4.0% de acrosoma intacto en espermatozoides de bovino refrigerado (5 °C) hacia las 24 horas, utilizando un diluyente a base de Tris-yema de huevo-fructosa. Los parámetros reproductivos de hembras inseminadas artificialmente reflejaron un comportamiento independiente respecto del tiempo en refrigeración y tipo de diluyente, excepto con TY, que mostró una disminución en el porcentaje de fertilidad conforme incrementa el tiempo en refrigeración. Entre algunos factores que intervienen de manera directa sobre los resultados, y en lo que respecta a la hembra, se encuentran el estado o condición fisiológica y edad de vida reproductiva (Castellini y Lattaioli, 1999); además de otros relacionados directamente con la técnica de IA, como es el método de inducción de celo e inducción a la ovulación (García y Rodríguez, 2002) y número de espermatozoides por dosis (Roca y col.,2000). Dixson y Anderson (2004) mencionan también que el tracto reproductor de la hembra es el que dispone el ambiente en que los espermatozoides tendrían que competir por fecundar sus ovocitos.

Los efectos favorables de la yema de huevo y la leche descremada para contrarrestar las alteraciones provocadas por el choque de frío se encuentran ampliamente comprobados en la refrigeración del semen en diferentes especies domésticas. Sin embargo, los complejos mecanismos relacionados con esta protección aún son objeto de investigación. Nuestros resultados reafirman la importancia que tiene la adición de la yema de huevo y la leche descremada al diluyente de conservación en refrigeración del semen de conejo, dado los beneficios en la preservación de la movilidad, la estabilización de la membrana plasmática y acrosomal, los cuales demostraron ser suficientes para lograr la fertilización. No obstante, estudios posteriores deberán contemplar factores de relación directa con los parámetros evaluados en este trabajo, como raza, estacionalidad reproductiva, línea genética, condición fisiológica, así como el estudio de diferentes componentes del diluyente de conservación seminal. Lo anterior, con el propósito de mejorar el mantenimiento y la funcionalidad de la célula espermática, además de preservar el potencial de fertilización de los espermatozoides bajo protocolos ya sea de refrigeración o de congelación, con la finalidad de transmitir a futuras poblaciones cunícolas características reproductivas y productivas competitivamente deseables.

5. Conclusión

La tolerancia del semen de conejo a la conservación a 5 °C hasta 24 horas, medida en términos del mantenimiento de los parámetros básicos de calidad espermática (movilidad, vitalidad, morfología) e integridad acrosomal, está influida por el diluyente utilizado. No obstante, la yema de huevo en su composición presenta un mejor desempeño en relación con el mantenimiento de los estándares básicos de calidad espermática respecto del diluyente a base de leche descremada. Sin embargo, los niveles reproductivos en hembras inseminadas artificialmente con semen refrigerado muestran un comportamiento independiente acerca del tiempo de conservación y diluyente empleado. Derivado de los resultados obtenidos en este trabajo se aconseja usar yema de huevo y leche descremada como importantes componentes del diluyente de conservación para las dosis de semen de conejo refrigerado, a las 24 horas a emplear en la inseminación artificial.