Caspasas en espermatozoide

1. Introducción

Las caspasas son proteínas que cortan a otras proteínas en residuos de ácido aspártico y que ejecutan un tipo de muerte celular llamado apoptosis. Éste es un proceso que se lleva a cabo de manera ordenada sin desencadenar una respuesta inflamatoria. En espermatozoides esta clase de muerte no está definida, pero la presencia de estas proteínas en dicha célula se ha vinculado a diversas alteraciones que puede sufrir el espermatozoide, como la congelación, o a patologías humanas.

2. ¿Qué es la apoptosis?

La apoptosis es un tipo de muerte celular en donde se eliminan células individuales. Sucede de manera ordenada y regulada, por lo que muchas veces se le define como “muerte celular programada” (preparación de la maquinaria necesaria para ejecutar una actividad en el momento deseado), aunque no es la única muerte celular programada (Galluzzi y col., 2015; Kroemer y col., 2009; Parrish, Freel y Kornbluth, 2013). En las células somáticas, la apoptosis presenta una serie de cambios morfológicos, como la pérdida de la integridad de la membrana plasmática, la condensación y fragmentación de cromatina, así como el empaquetamiento de los fragmentos celulares en vesículas formadas de membrana plasmática (cuerpos apoptóticos) (Earnshaw y col., 1999; McIlwain y col., 2013). Además de los cambios morfológicos, se pueden reconocer modificaciones bioquímicas, como las que suceden en la superficie de la membrana que inducen la externalización de la fosfatidilserina (PS) (Elmore, 2007); el rompimiento del ADN en fragmentos regulares, normalmente múltiplos de aproximadamente 200 bp (Elmore, 2007), así como la escisión de subconjuntos de polipéptidos y proteínas (Earnshaw y col., 1999).

El corte de las proteínas se lleva a cabo por una familia de proteasas llamadas caspasas (Earnshaw y col., 1999). La muerte celular por esta vía puede ocurrir en respuesta a varios tipos de estrés celular, daño al ADN, privación de factores de crecimiento, estrés de retículo endoplásmico y señales del medio ambiente, entre otras. También la pueden activar otras causas, como la radiación, toxinas, hipoxia, hipertermia y radicales libres (que provocan estrés dentro de la célula) (Green y Llambi, 2015).

3. ¿Qué son las caspasas?

Las caspasas son proteínas que cortan después de residuos de ácido aspártico (Cade y Clark, 2015; Grunewald y col., 2009) y este corte depende de un residuo de cisteína presente en su sitio catalítico (McIlwain y col., 2013). Son proteínas que se generan como proenzimas o zimógenos (proteína a partir de la cual se creará una enzima activa) y se llaman procaspasas al momento en que están inactivas. Para activarlas es necesario que ocurra una serie de cambios que les permitan madurar y cumplir su función. La estructura de las procaspasas contiene un prodominio (sección de una proteína que contribuye a su conformación tridimensional) N- terminal, seguido por una subunidad larga y una corta (fig. 1). En algunas procaspasas esta subunidad está separada por un pequeño espacio que es eliminado del zimógeno durante la maduración de la enzima.

Todas las escisiones involucradas en la maduración de las procaspasas se llevan a cabo en los carboxilos de los residuos de aspartato. Otra estructura que se puede identificar en estas proteínas son los prodominios, dentro de los cuales es posible reconocer dos motivos (secuencia de aminoácidos altamente conservada): el dominio efector de muerte (DED, por sus siglas en inglés, death effector domain) y que aparentemente está involucrado en la interacción con otras proteínas que señalizan muerte, como son MORT1/FADD y TRADD; y el dominio reclutador de caspasas (CARD, caspase recruitment domain), que es importante para la interacción de las caspasas maduras con otras enzimas, además de su relación con proteínas adaptadoras y reguladoras (Earnshaw y col., 1999).

Las caspasas con prodominios cortos de alrededor de 23 aminoácidos (por ejemplo, las 6 y 7), al parecer, están involucradas en la iniciación de la respuesta apoptótica, por lo que se les denomina iniciadoras. Las caspasas con prodominios de alrededor de 219 aminoácidos (por ejemplo, la caspasa 10) son llamadas efectoras, las cuales deben ser activadas por las iniciadoras (fig. 1) (Earnshaw y col., 1999).

Para que una procaspasa se active es necesario que pase por una serie de procesos que le ayudarán a madurar; el primer paso es su dimerización con otra procaspasa, ya que este tipo de enzimas se activan a través de “proximidad inducida”, es decir, cuando la proteína llamada adaptador interactúa con el prodominio de otra proteína de la misma identidad (Fig. 1). Esto resulta en la formación de un tetrámero compuesto por dos unidades iguales que se unen en pares. El proceso continúa con al menos dos escisiones más que separan la subunidad larga de la subunidad pequeña. Los nuevos extremos se pliegan sobre los dímeros, promoviendo cambios conformacionales para crear dos sitios activos en la que ahora será la caspasa madura, seguido de la remoción de los prodominios. Sin embargo, se ha sugerido que esta eliminación no siempre es necesaria (fig. 1) (Cade y Clark, 2015; Earnshaw y col., 1999; Green y Llambi, 2015).

Figura 1. Estructura y proceso general de activación de caspasas iniciadoras y efectoras.  Autora: Blanca Patricia López-Trinidad.

3.1 Tipos de caspasas

Como se mencionó anteriormente, las caspasas se pueden clasificar según los dominios que contienen: las iniciadoras tienen un prodominio, un dominio largo y uno corto, mientras que las efectoras sólo tienen el dominio largo y el corto. Otra manera de clasificarlas es de acuerdo con su función, como caspasas inflamatorias y apoptóticas, estas últimas a su vez pueden ser divididas según su estructura y función como iniciadoras o efectoras (Fig. 2).

Figura 2. Representación de los diferentes tipos de caspasas. Autora: Blanca Patricia López-Trinidad.

Las caspasas apoptóticas iniciadoras (CAI) son monómeros estables y se activan por dimerización (fig. 1), tras la cual adquieren la capacidad de autoprocesamiento, por lo que pueden escindir la unión entre el prodominio y la unión entre la subunidad larga y la corta. Este mismo procedimiento lo llevan a cabo las efectoras (con la diferencia de que no poseen un prodominio). Aun después de su dimerización, las caspasas apoptóticas efectoras (CAE) todavía no se encuentran activas y es necesario que sean escindidas por las CAI para que se activen. Al igual que las caspasas apoptóticas, las inflamatorias se activan por dimerización (fig. 2) (Cade y Clark, 2015).

4. Vías de activación de las caspasas

La caspasa 8 es la caspasa iniciadora más estudiada de la vía de apoptosis extrínseca, es decir, la que se activa mediante señales de muerte que vienen del exterior. Una de las vías extrínsecas importantes se relaciona con la activación de la superfamilia de receptores del factor de necrosis tumoral (TNFR), que posee un dominio extracelular rico en cisteína y un dominio citoplasmático de alrededor de 80 aminoácidos, llamado “dominio de muerte” (DD) (Elmore, 2007). Este receptor recibe a un ligando de muerte (por ejemplo, FasL o TNF-alfa), induciendo su oligomerización y favoreciendo el reclutamiento del complejo de señalización de inducción de muerte (DISC). DISC está formado por proteínas que contienen e interactúan a través del DD (fig. 3), como por ejemplo FADD (dominio de muerte asociado a FAS) o TRADD (dominio de muerte asociado al receptor de TNF).

FADD o TRADD, a su vez, exponen su dominio DED (dominio efector de muerte) que le ayuda a interactuar con la caspasa 8, que también contiene un dominio DED, lo que provoca que los monómeros de la caspasa 8 entren en proximidad y se dimerizan, lo cual incita que se active y ocurran las escisiones necesarias para que la enzima madure totalmente (fig. 1). A partir de este paso la ruta puede tener varias alternativas: que la caspasa 8 activa las caspasas efectoras 3 y 7 o que escinde o corte a Bid (proteína proapoptótica que pertenece a la familia BH3), que desencadenará la muerte por la vía mitocondrial (Nair y col., 2014) (Fig. 3A).

Figura 3. Esquematización de la vía de activación general de algunas caspasas. Autora: Blanca Patricia López-Trinidad.

La caspasa más estudiada en la muerte celular por la vía intrínseca es la caspasa 9, ya que formará parte del apoptosoma. Lo anterior es regulado por factores externos e internos, provocando alteraciones en la membrana mitocondrial, como la formación de los poros de transición de permeabilidad mitocondrial (MPT), lo que provoca la pérdida del potencial de membrana y la liberación de dos grupos principales de proteínas proapoptóticas que normalmente están secuestradas en la mitocondria y que escapan hacia el citosol (Elmore, 2007). El primer grupo de proteínas proapoptóticas está formado por el citocromo c, Smac/DIABLO y HtrA2/Omi, que activan la vía mitocondrial dependiente de caspasa. El citocromo c se une a Apaf 1 y a la procaspasa 9 para formar el “apoptosoma”, que es un heptámero de 7 subunidades de cada una de las proteínas antes mencionadas. Esta unión favorecerá la activación de la procraspasa 9, convirtiéndose en la caspasa 9 activa (fig. 3B). Por otro lado, Smac/DIABLO y HtrA2/Omi inducen la apoptosis, inhibiendo a las proteínas que impiden la apoptosis (IAP) (Elmore, 2007; Green y Llambi, 2015; Kuhlbrandt, 2015; Schultz y Harrington, 2003).

La caspasa 1 es la más importante en los procesos inflamatorios, asociada principalmente a la piroptosis, un tipo de muerte celular inflamatoria, acompañado de la liberación del contenido citosólico, coincidiendo con la apoptosis en la desintegración del ADN, pero en este fenómeno se visualiza la ruptura en forma de escalera. Durante el proceso, la caspasa que cumple la función iniciadora y efectora es la caspasa 1 (Lin y Zhang, 2017), misma que está involucrada en el procesamiento de citocinas (pequeñas proteínas secretadas principalmente por las células T ayudadoras por los monocitos; Zhang y An, 2007), las cuales tienen un efecto específico en la interacción y comunicación entre células. Particularmente, la caspasa 1 puede activar al precursor de la interleucina 1 B (pro-IL-1B, citocina implicada en procesos inflamatorios).

La descripción anterior ayudará a entender el funcionamiento de las caspasas que hasta el momento se han encontrado en espermatozoides.

5. Caspasas en espermatozoides

De manera general, la presencia de caspasas (1, 3, 9, 8) en espermatozoides eyaculados siempre se ha asociado a una mala calidad espermática, lo cual también se puede relacionar con la muerte celular. A continuación discutiremos los reportes donde existe presencia de caspasas y bajo qué condiciones se presentan.

5.1 Caspasas asociadas con la infertilidad masculina

En diversos estudios se ha abordado la relación que tiene la presencia de las caspasas activas con la baja movilidad de los espermatozoides. Los primeros análisis los realizaron Weng y colaboradores en el 2002, en los que separaron los espermatozoides de pacientes infértiles, así como de donadores sanos, utilizando concentraciones discontinuas de percoll (45% y 90%), marcando a los espermatozoides con anticuerpos fluorescentes para caspasas activas; se encontró una mayor cantidad de caspasa 3 activa en la porción de baja movilidad (45% de percoll), exclusivamente en la pieza media de los espermatozoides tanto de los donadores sanos como de los pacientes infértiles, por lo que propusieron que la apoptosis dependiente de caspasas puede ser desencadenada en la región donde se encuentran las mitocondrias y la gota citoplásmica de espermatozoides anormales e inmaduros.

Conjuntamente, determinaron la actividad general de las caspasas y encontraron que en pacientes infértiles es mayor, aún en la fracción de alta movilidad. Debido a que el espermatozoide tiene escaso citoplasma, los autores plantean que la actividad de la caspasa 3 en hombres sanos es más eficiente, por lo que requiere niveles bajos. Además de que en la fracción de alta movilidad muestran una correlación negativa entre la movilidad y la actividad de las caspasas. En este mismo estudio cuantificaron la fragmentación del ADN y observaron una correlación positiva entre dicha fragmentación y la presencia de caspasa 3 en los espermatozoides (Weng y col., 2002).

No obstante, no fueron los únicos que detectaron caspasas relacionadas con problemas en los parámetros espermáticos, ya que Paaschycolaboradores, en el 2003, encontraron caspasas en espermatozoides, separando previamente la muestra entre los que presentaban exposición de PS y aquellos que no la presentaban. En general, los donadores mostraban bajos niveles de caspasas en comparación con los pacientes infértiles. Sin embargo, los espermatozoides que presentaba externalización de PS registraban altos niveles de caspasas tanto en donadores sanos, como en pacientes con infertilidad (Paasch y col., 2003). Esto coincide con investigaciones en las que discuten que las modificaciones de la funcionalidad de la membrana también pueden estar ligadas con la actividad de la caspasa 3, la cual escinde proteínas cinasas, modificando así la migración bidireccional de los fosfolípidos a través de la bicapa lipídica, por la retención de la actividad de la escramblasa (Frasch y col., 2000). Paasch y colaboradores también argumentan que es un elemento residual de la espermatogénesis y son propensas a activarse debido al daño en la membrana. Además de que la presencia de caspasas indica un defecto o remodelación incompleta del citoplasma durante la espermatogénesis, ya que encontraron marcaje de caspasas (1 y 9) en la pieza media, específicamente en el citoplasma residual de pacientes, mientras que en los donadores se localizaba en la región posacrosomal.

Otros estudios se han enfocado en determinar la relación de las caspasas, así como la liberación del citocromo c, detectando un aumento de las especies reactivas del oxígeno (ERO) y la concentración de citocromo c en el plasma seminal, además de encontrar marcaje de caspasa 3 en la pieza media, por lo que sugieren que hay una posible relación entre el incremento del daño indicado por el estrés oxidante y la apoptosis mediada por CP en pacientes con un factor de infertilidad masculina.

5.2 Activación de caspasas por congelación

Una de las técnicas en las que se apoya la reproducción animal asistida es la congelación de gametos, la cual consiste en someter las células a bajas temperaturas para disminuir su metabolismo y de este modo preservarlas; sin embargo, es imprescindible que se usen compuestos que deshidraten a las células para evitar la formación de cristales dentro y fuera de ella, a los que llaman crioprotectores.

Entre los crioprotectores más comunes está el glicerol. Grunewald probó dos concentraciones diferentes de glicerol (7% y 14%) y observó el efecto que tenía sobre la activación de las caspasas durante el proceso de congelación. Encontró que éste provoca el aumento de todas las caspasas medidas en el estudio (1, 3, 8 y 9), tanto en donadores sanos, como en pacientes infértiles. Dentro de las peculiaridades que reportan es que tanto la caspasa 8 como la 9 aumentan a altas concentraciones de glicerol y de manera significativa también lo hacen en las muestras que provenían de pacientes infértiles. Mientras que los precursores de la caspasa 3 (32 kDa) disminuyen cuando se incrementan las concentraciones de antioxidantes como el glutatión (Grunewald y col., 2005).

En 2004, Paasch ya había reportado la activación de las caspasas durante la congelación, mencionando que conduce a la activación de las caspasas 1, 8, 9 y 3, y que además se relaciona con la externalización de fosfatidilserina. Para corroborar este último punto se separaron las células positivas y negativas a fosfatidilserina, encontrando un aumento de todas las caspasas en la porción de espermatozoides que presentaron exposición de fosfatidilserina (Paasch y col., 2004).

La criopreservación y los crioprotectores pueden desencadenar la muerte celular programada, asociada a la integridad de la membrana y la activación de caspasas; esto puede deberse a que la criopreservación de los espermatozoides conduce a varias alteraciones estructurales y funcionales de la membrana plasmática, que pueden llevar a la pérdida de la estabilidad de la bicapa lipídica y a un crio-daño subletal de espermatozoides. Esta falta de integridad de la membrana puede iniciar la cascada de las caspasas. Los crioprotectantes, como ejemplo el glicerol, por sí mismo tiene la capacidad de contribuir a la activación de las caspasas vía los efectos tóxicos sobre la mitocondria, ya que el estrés citotóxico conlleva perturbaciones mitocondriales, seguido de fragmentación del ADN (Grunewald y col., 2005).

5.3 Activación de caspasas por peróxido y progesterona

Se ha demostrado, en repetidas ocasiones, que el calcio juega un papel importante en la señalización de la muerte en células somáticas y, por lo tanto, en la activación de las caspasas. La progesterona puede ser un poderoso movilizador de calcio en los espermatozoides (Demaurex y Distelhorst, 2003), permitiendo la salida de los sitios de almacenamiento o generando una serie de reacciones que permiten la entrada de este ion. Existen diversos componentes intracelulares sensibles a concentraciones de calcio, como la mitocondria, por lo que una elevación de la concentración puede inducir apoptosis, ya que puede promover la liberación de factores (como el citocromo c) que además perjudican la función mitocondrial.

En espermatozoides se ha probado el efecto de la progesterona sobre la activación de las caspasas en ellos, encontrando que a partir de una exposición de 15 y hasta 120 minutos con 20 μM de progesterona hay un aumento en la cantidad de caspasa 3 activa, así como de la caspasa 9; este efecto se acentuó cuando los espermatozoides fueron sometidos por 60 minutos con 10 μl de progesterona. Estos efectos se ven disminuidos cuando los espermatozoides son tratados con DEVD-CMK o z-LEHD-FMK (inhibidores de caspasa 3 y 9) (Bejarano y col., 2008). En otros estudios también se ha reportado un incremento de la caspasa 3 activa usando la misma concentración de progesterona (Bejarano y col., 2008). La importancia de lo anterior radica en que en células somáticas el calcio tiene una función importante en la señalización de muerte; sin embargo, en espermatozoides se le puede dar un papel dual a este componente, ya que la progesterona es una hormona esteroidea que induce la entrada de calcio en el espermatozoide y provoca múltiples respuestas fisiológicas esenciales para que se lleve a cabo la fertilización (Lishko y col., 2011), además de que puede efectuar procesos como la muerte de la misma célula.

Por otro lado, el peróxido de hidrógeno (H2O2) es una ERO que, además de poder movilizar calcio, hace modificaciones a otras proteínas, provocando la activación de caspasas y eventualmente la muerte (Bejarano y col., 2008). En espermatozoides, usando 10 μM de H O durante 60 minutos, se obtiene la mayor activación de caspasa 3 (Bejarano y col., 2008; Demaurex y Distelhorst, 2003) e irónicamente, concentraciones altas de H2O2 no producen un cambio significativo en la activación de las caspasas (Bejarano y col., 2008). Es importante considerar que si bien las ERO tienen la capacidad de causar daño en el espermatozoide, también pueden participar en procesos importantes en la fisiología espermática, activando o inactivando proteínas para que se cumplan procesos como la activación de la movilidad, a través del incremento del adenosín monofosfato cíclico (AMPc) y la fosforilación de proteínas, para la adquisición de su capacidad fertilizante. Así, entre los efectos negativos y positivos de las ERO a los espermatozoides, parece que el buen funcionamiento dependerá de su adecuada regulación por los antioxidantes (Arenas-Ríos y col., 2014).

5.4 Otras asociaciones

La activación de las caspasas en los espermatozoides también se ha relacionado con las personas fumadoras, ya que se ha demostrado el impacto del humo de cigarro en la infertilidad masculina (Soares y Melo, 2008). En 2011 (El-Melegy y Ali, 2011) se realizó un estudio que analizó el porcentaje de caspasa 3 activa en espermatozoides de donadores sanos y en pacientes fumadores y no fumadores, demostrando que los pacientes infértiles que eran fumadores presentaban una mayor cantidad de esta caspasa, en comparación con los otros grupos; esta condición se exacerbaba de manera significativa en aquellas personas excesivamente fumadoras, lo que quiere decir que tenían alrededor de 17 años siendo adictas y consumiendo por lo menos 23 cigarros al día (El-Melegy y Ali, 2011). Esto puede deberse a una desregulación en el eje hipotálamo-hipófisis- testículo o a la hipoxia leve causada por la disrupción de la microcirculación testicular, pero un efecto tóxico de los compuestos químicos del cigarro sobre el epitelio testicular está más relacionado, aunado a un impacto adverso provocado por las ERO en los espermatozoides, las cuales pudieran ser las causantes del daño ligado a la baja concentración de antioxidantes (El-Melegy y Ali, 2011).

A pesar de que en muchos estudios se hace la comparación entre hombres sanos e infértiles, los infértiles no tienen una patología asociada a su infertilidad como el varicocele. Éste se caracteriza por una dilatación anormal y retrógrada del fluido sanguíneo en las venas testiculares, condición que provoca infertilidad (Tsili y col., 2017). Además, se ha demostrado que esta condición favorece un aumento en la cantidad de caspasa 9 en los espermatozoides. El estrés oxidativo es uno de los probables causantes del daño en estos espermatozoides, ya que se ha propuesto que durante el varicocele se genera esta condición de estrés (Zalata y col., 2011).

Otras investigaciones relacionan a las caspasas con el estatus maduracional de los espermatozoides, las cuales se basan en la separación de espermatozoides a través de centrifugación en un gradiente de concentración, obteniendo una fracción que se consideraron como espermatozoides maduros (los espermatozoides encontrados en la interfase entre el gradiente de 47% y 90%) e inmaduros (los localizados sólo en el gradiente de 90%); en ambos casos se les determinó la cantidad de caspasas 9, 8 y 3, encontrando una mayor cifra en los inmaduros (Paasch y col., 2003). Lo anterior puede deberse a una maduración incompleta durante su tránsito por el epidídimo (Paasch y col., 2003).

6. Conclusión

A pesar de que diversos estudios asocian la mala calidad espermática con la presencia de caspasas (1, 3, 9, 8), estos análisis no son concluyentes, ya que se desconocen las vías de señalización en las que participan específicamente en espermatozoides; además, se debe considerar que se ignora qué ocurre con estas proteínas cuando el espermatozoide transita por el epidídimo. Por lo que es necesario realizar más estudios que ayuden a esclarecer el papel de las caspasas en la fisiología espermática durante su formación y maduración postesticular.

Glosario

ADN: Ácido Desoxirribonucleico. Polinucleótido formado por la unión covalente entre unidades de desoxirribonucleótidos; actúa como transportador de la información genética.
Apaf 1: Proteasa activadora del factor 1 de la apoptosis.
bp: Pares de bases.
CAI: caspasas apotóticas iniciadoras. CAE: caspasas apoptóticas efectoras.
CARD: Dominio de reclutamiento de caspasas (caspase recruitment domain).
DED: Dominio efector de muerte (death effector domain).
DIABLO: Proteína de unión directa a IAP con bajo pI (direct IAP-binding protein with low pI).
DISC: complejo de señalización de inducción de muerte.
DD: Dominio de muerte.
FADD: Proteína asociada a Fas con dominio de muerte (Fas-associated protein with death domain).
FasL: Ligando de Fas.
HtrA2/Omi: Serina peptidasa mitocondrial HtrA2, también conocido como Omi.
IAP: Proteínas inhibidoras de la apoptosis. PS: Fosfatidilserina.
Pro-IL-1B: Precursor de la interleucina 1 B.
Smac: Segundo activador de caspasas derivado de mitocondrias (second mitochondria-derived activator of caspases).
TNFR: Receptor del factor de necrosis tumoral.
TRADD: Receptor del factor de necrosis tumoral tipo 1 asociado al dominio de muerte (Tumor necrosis factor receptor type 1-associated DEATH domain).