Características del eyaculado y el espermatozoide de las serpientes

1. Introducción

México es uno de los países megadiversos, cuenta con 393 grupos de serpientes (Paredes-García y col., 2011; Flores-Villela y García-Vázquez, 2014). Esta riqueza ha formado parte de la cosmovisión de las culturas prehispánicas del país, en particular entre los aztecas, quienes representaron a Quetzalcóatl con una serpiente con aureola de plumas y cuerpo ondulante cubierto también de plumas cuya cola culmina con los típicos anillos (Bueno, 2000), y los mayas plasmaron con esta misma figura al dios Kukulkán en la pirámide de Chichén Itzá, que durante el equinoccio de primavera la luz del Sol ilumina la escalinata, formando el cuerpo de la serpiente que baja hasta la base de la pirámide, donde se une a la cabeza de un crótalo (Ojeda, 2004, en Fuentes-Mascorro et al. 2015). En la fachada del palacio del gobernador en Uxmal se encuentra lo que puede ser considerado como el primer modelo de geometría natural, que toma los rombos de la piel de la serpiente de cascabel como patrón; para los mayas, además, este rombo significa certidumbre matemática, de allí proviene el concepto de cielo cuadrado, las cuatro fases de la luna y los puntos cardinales (Bueno, 2000). En la iconografía y la arquitectura olmeca, maya, zapoteca y azteca, así como en el escudo nacional, la serpiente que se aprecia es del género crótalo (Fuentes-Mascorro, 2014).

De acuerdo con Gómez y col., 2005, se expende sin ningún control sanitario o de origen carne y cápsulas que en teoría son de serpiente de cascabel, con la promesa de que combate el síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) y cáncer; Camacho-Escobar et al. (s/f) indican que en la costa de Oaxaca la carne de Crotalus aquilus, molida y disuelta en agua, es empleada para tratar la enfermedad de Newcastle en guajolotes (Meleagris gallopavo). Si a esto le sumamos que, de acuerdo con la Organización Mundial de la Salud, cada año se producen 5.4 millones de mordeduras, que causan de 1.8 a 2.7 millones de casos de envenenamiento y de 81,410 a 137,880 muertes (Siria y Arellano, 2009), las serpientes venenosas son sacrificadas en busca de su carne y por la interacción con los seres humanos, pues el accidente ofídico se ha tornado un problema de salud pública y ha colocado a algunas de las especies en la categoría de sujetas a protección o amenazadas, de acuerdo con la Norma Oficial Mexicana 059-SEMARNAT-2010.

En los últimos años, el incremento de la herpetofilia ha provocado el desplazamiento de especies muy lejos de los lugares donde habitaban originalmente, incrementando con esto la necesidad de producir faboterápicos no sólo para las especies de distribución local, sino también para las que llegan a los países a través del mercado legal y del comercio ilegal. El decomiso de estos ejemplares y su puesta en resguardo facilita la obtención del material biológico necesario para producir antídotos, además de permitir el estudio y aislamiento de proteínas para su posible empleo como fármacos, lo que cobra un nuevo e interesante sentido a partir de la publicación de los estudios de Casewell et al, 2012, quienes encontraron la anidación de genes que codifican para proteínas con roles fisiológicos dentro de los clados de las toxinas del veneno.

El Laboratorio de Investigación en Reproducción Animal (LIRA) de la Universidad Autónoma “Benito Juárez” de Oaxaca (UABJO), en colaboración con el Herpetario Reptilium y el Zoológico de Zacango, ha mantenido en los últimos años una línea de investigación enfocada en la aplicación de técnicas de reproducción asistida en reptiles, orientadas en un inicio a la conservación de semen para su posterior uso en la inseminación artificial de hembras que se encuentran lejos del ejemplar macho. En las siguientes páginas se presentan los avances que se han tenido.

2. Técnica de extracción de semen (Fuentes-Mascorro y Álvarez, 2016)

Una vez observada la conducta de apareamiento en elápidos vipéridos y colúbridos, se diseñó una técnica que permite extraer semen en ejemplares de estas tres subclases. Básicamente consiste en la contención del animal por personal capacitado; por seguridad de quien hace la contención y del ejemplar, se maneja en un tubo herpetológico transparente, donde se introduce el tercio anterior de su cuerpo, asegurando su no retorno. El técnico que realiza la extracción procede a dar un masaje ventral cráneo- caudal en el tercio distal del cuerpo del ejemplar y circular en el área del esfínter cloacal y en los esfínteres de acceso a las bolsas de los hemipenes; una vez que la serpiente relaja los esfínteres, se procede a introducir diluyente a 28ºC en la cloaca y los sacos de los hemipenes, acto seguido se ejerce presión sobre la región para que expulse el líquido (no siempre retorna el líquido de la cloaca, en ocasiones el animal lo retiene o lo absorbe), con papel suave se retira el exceso de líquido. Los machos que están o han estado en actividad sexual arrojan un material gelatinoso de los sacos de los hemipenes y da inicio la expulsión de líquido que contiene espermatozoides; el eyaculado puede tener consistencia de pastosa a líquida y los espermatozoides presentes en él no siempre tienen movimiento. Bajo esta técnica en ejemplares en actividad sexual se ha logrado obtener hasta 30 improntas, cabe considerar que no es necesario que el ejemplar evierta los hemipenes para eyacular.

Es muy probable que el material gelatinoso que sale de los sacos de los hemipenes corresponda a semen que ha sido eyaculado a pesar de la ausencia de la hembra y que pase por el conjunto de surcos que comunican la cloaca con las bolsas de los hemipenes. Este material puede ser blanco, amarillento o grisáceo si tiene mucho tiempo en el lugar, se puede encontrar en la entrada de los sacos de los hemipenes seco y adherido a la piel del ejemplar; de ser así, se recomienda retirarlo humedeciendolo con líquido tibio para evitar erosionar la piel.

3. Evaluación macroscópica

El eyaculado de las serpientes se emite por ondas de eyaculación; cuando el macho está copulando con la hembra se registra una fase de estimulación. En crótalos, la hembra se queda quieta y el macho, una vez que ha hecho la intromisión del hemipene en la cloaca de la hembra, avanza reptando sobre el cuerpo de ella, realizando un movimiento lateral con la cabeza hacia ambos lados; cuando llega a la altura de la cabeza de la hembra, regresa su cuerpo y eyacula, e inicia otra sesión de estimulación, una cópula puede durar hasta 18 horas. Cuando se extrae el semen de los machos, se estimula al ejemplar simulando la sensación que tendría de estar reptando sobre la hembra y eyacula una gota de semen, que puede ser de translúcida a blanca lechosa, con una consistencia de líquido a mucoso, de un volumen muy bajo; luego se realiza una nueva sesión de estimulación y así sucesivamente. En ejemplares de colúbridos, la cópula se efectúa entrelazándose los ejemplares desde el tercio medio hasta el tercio posterior, el macho introduce el hemipene en la cloaca de la hembra y desliza su cuerpo entrelazándolo al de la ella para completar un “abrazo nupcial”, eyaculando como acto seguido; relaja el cuerpo que se mantiene entrelazado y se repite la estimulación, proceso bajo el que se han logrado hasta 20 eyaculados por sesión. El eyaculado es traslúcido y cómo máximo se ha obtenido una cantidad de 250 μL. Cuando estos animales no se encuentran en época reproductiva, no eyaculan.

En la mayoría de las ocasiones los eyaculados se colectan por impronta en un portaobjetos temperado a 28 ºC, se confirma por observación en el microscopio que la impronta contenga espermatozoides, se vierten 10μL del diluyente que se esté empleando en la laminilla, se mezclan con una punta y se transfiere el eyaculado diluido a un tubo Eppendorf para su posterior procesamiento. Cabe hacer notar que cuando el eyaculado es espeso no coagula como el de los humanos, por lo que de no diluirse se seca; si la impronta no se diluye rápidamente, también se seca. Colúbridos, vipéridos y elápidos pueden eyacular espermatozoides sin movimiento, que a la tinción eosina-nigrosina están vivos; se ha observado que una vez que están diluidos, con el tiempo empiezan a presentar movimiento y que de manera indistinta en el eyaculado pueden salir espermatozoides con y sin movimiento, sin ningún patrón. El pH se ha determinado empleando tiras reactivas, obteniéndose en todos los ejemplares 7.0 como valor, dato que debe tomarse con reserva en virtud de que las tiras reactivas son poco sensibles y la escala de pH es logarítmica.

4. Evaluación microscópica

Movilidad masal es la forma en que los espermatozoides se mueven en grupo; se coloca el portaobjetos que tiene la impronta en el microscopio y se enfoca con el objetivo de 10X: se asigna un 5 cuando los espermatozoides se desplazan en grupos, formando remolinos vigorosos similares a los de un cardumen en movimiento; 4 a remolinos con menor vigor; 3 cuando no hay remolinos, pero sí movimiento grupal; 2 si existe movimiento en grupos de pocos espermatozoides; 1 cuando la actividad en grupos se reduce a unos cuantos espermatozoides en movimiento y 0 sin movimiento. De acuerdo con esta escala, los eyaculados de animales en plena estación reproductiva presentan una movilidad masal de 5.

Se encontró un movimiento cooperativo en los espermatozoides de Crotalus atrox que consiste en grupos de cientos de ellos que coordinan su batido flagelar para avanzar en una misma dirección (Fuentes-Mascorro y col., 2013), fenómeno que ha sido reportado en Parachauliodes japonicus (Hayashi, 1998) y en Rattus norvegicus (Pizzari y Foster, 2008); los videos que se han grabado contienen imágenes similares (Fig. 1) a las del artículo de Moore y col., 2002.

Figura 1. Conjunto de espermatozoides de C. atrox atrapado en tejido de descamación; sincronizan el batido de sus flagelos para impulsarse de manera coordinada e incrementar el efecto del movimiento, la parte más oscura corresponde al conjunto de cabezas 40X.

Morfología. El espermatozoide de los reptiles presenta una forma característica (fig. 2), distinguiéndose una cabeza y flagelo; en la parte anterior de la cabeza se ubica el acrosoma que termina en punta, inclinada a la derecha o a la izquierda y anterior a ella, antes de la fosa de implantación se ubica el núcleo, que presenta en conjunto con el acrosoma la forma de una pirámide, se continúa con una pieza media que es muy larga y finaliza en una cola que parece estar desnuda de membrana, como sucede en los espermatozoides de mamíferos.

Reuniendo la información de las anormalidades observadas a lo largo de cuatro años de evaluación de eyaculados de serpientes, se ha encontrado que, del cien por ciento de anormalidades, la cabeza presenta 21.76%, el flagelo 30.57%, con dos o más anormalidades el 47.67%. Las cabezas dobladas e hinchadas son el tipo de anormalidad presentada y en el flagelo se observó forma de ovillo, doblado sobre sí, desviaciones angulares en ondas, enrollado y la presencia de dos colas, algunos presentan la cabeza hinchada y la cola doblada. En las Figuras 3 a 8 se presentan algunas de las anormalidades encontradas.

Figura 2. Espermatozoide de Crotalus spp. Se aprecia la cabeza que presenta el núcleo teñido de azul y el acrosoma translúcido, el flagelo con una pieza media extremadamente larga y una cola final aparentemente desnuda 40X.

Figura 3. Espermatozoides de C. molossus nigrescens teñidos con fucsina básica a 40X, se aprecia la ausencia de cabezas.

Figura 4. Espermatozoides de C. molossus oaxacus teñidos con fucsina básica a 40X. Las flechas azules señalan defectos en la fosa de implantación.

Figura 5. Espermatozoides de C. ravus ravus teñidos con hematoxilina a 40X. Se advierte pieza media doblada en la parte superior; a la izquierda, cola doblada y abajo, flagelo doblado sobre sí, formando un ocho.

Figura 6. Espermatozoides de Stenorrhina f. Tinción eosina-nigrosina, con filtro a 40X. Se aprecian cabezas hinchadas en la parte superior derecha, al igual que agrupamiento de espermatozoides; conforme se va secando la muestra tienden a asociarse en formación.

Figura 7. Espermatozoides de C. molossus nigrescens teñidos con eosina-nigrosina. Se distingue en el espermatozoide inferior la cabeza deforme y dos colas al final del flagelo.

Figura 8. Espermatozoides Crotalus spp. Tinción eosina-nigrosina a 40X, con acercamiento de la cámara. Se aprecia diferente grado de hinchamiento de la cabeza.

En la Figura 9 se aprecia el núcleo, la fosa de implantación o cuello, parte de la vaina mitocondrial y las fibras densas del flagelo; la membrana se nota delgada y lábil a las técnicas empleadas para su procesamiento. La Figura 10 muestra la estructura de la pieza media o pieza principal del flagelo, con una membrana plasmática bien definida, el agrupamiento de mitocondrias que la caracteriza y la vaina fibrosa. En la Figura 11 se puede apreciar la diferencia entre la pieza media y la cola o pieza final del flagelo, que no está rodeada por la membrana celular.

Figura 9. Fotomicrografía electrónica de transmisión. La flecha marca una membrana plasmática delgada, electrodensa e irregular, que se extiende hasta la parte media. El núcleo (N) alargado y electrodenso. El cuello del espermatozoide (CE). Técnica de contraste general con acetato de uranilo y citrato de plomo. Aumento 12 000X.

Figura 10. Fotomicrografía electrónica de transmisión. Pieza media (PM) o parte principal. Membrana celular (MC) electrodensa, mitocondrias (M) y vaina fibrosa (Vf). Técnica de contraste de uranilo y citrato de plomo. Aumento 7 000X.

Figura 11. (PF) o cola, se observa el axonema rodeado por fibras densas externas electrodensas, un corte transversal de pieza media (PM) rodeada de mitocondrias (M). Técnica de contraste con acetato de uranilo y citrato de plomo. Aumento 12 000X.

Figura 12. Espermatozoides de Crotalus spp teñidos con rodamina B y yoduro de propidio microscopía confocal; se puede apreciar la heterogeneidad de las cabezas, lo largo de la pieza media y la integridad del acrosoma, a pesar del hinchamiento del núcleo, por lo que pudiera tratarse de descondensación del ADN.

Figura 13. Microscopía de fluorescencia. El núcleo se aprecia en color azul (Hoechst) y con verde se distingue el anticuerpo que se une a la acuaporina 1.

Vivos-muertos. Manejar los datos de espermatozoides vivos y muertos representó algunas dificultades sustanciales. Con la tinción de eosina-nigrosina ocupada en mamíferos (Campbell y col., 1956), los espermatozoides de las serpientes empezaron a presentar inconvenientes como los que se muestran en las figuras 7 y 8, por lo que primero se realizó un estudio de osmolaridad con soluciones de 200, 300, 400 y 500 mOsm/L en Crotalus molossus, Crotalus atrox y Crotalus culminatus; se encontró estrés osmótico en todas las soluciones, sin diferencias entre especies, notándose que los espermatozoides responden a osmolaridades de 200, 400 y 500 mOsm/L, incrementando el volumen de la región que corresponde al núcleo y manteniéndose intacto el acrosoma (Simón-Salvador y col., 2016).

La osmolaridad de los espermatozoides de Boa constrictor, Morelia spilota, Pituophis deppei, Crotalus culminatus y Crotalus molossus, empleando soluciones de Tyrode modificado a 420, 440, 460 y 480 mOsm/L, evaluando a 0, 12, 24 y 36 horas de conservación a temperatura de 28ºC; se midió el porcentaje de hinchamiento (PH) en los espermatozoides y los resultados mostraron para Pituophis deppei que 460 mOsm/L conserva los espermatozoides en perfecto estado desde el tiempo 0 hasta 48 horas; para Boa constrictor, 420 mOsm/L presenta valores de 0 PH, para 0, 12 y 48 horas; Morelia spilota presenta los mejores resultados a 420 y 460 mOsm/L; Crotalus culminatus presenta los porcentajes más bajos de hinchamiento (2 a 40%) entre 460 y 480 mOsm/L, y para Crotalus molossus las cuatro osmolaridades parecen apropiadas, en virtud de que los PH van de 0 a 49; por la osmolaridad de la solución adecuada, depende del tiempo durante el cual se requiere conservar la muestra (Fuentes-Mascorro y col., 2015).

El espermatozoide de las serpientes responde con hinchamiento de la cabeza tanto a estrés hipoosmótico como hiperosmótico (fig. 12), por lo que actualmente se está buscando la distribución de acuaporina. En la figura 13 se advierte la presencia de acuaporina 1 en la región del acrosoma, debido a que estas proteínas son capaces de permitir la entrada o salida de agua en contra del gradiente osmótico.

Diluciones. Para conservar los espermatozoides en movimiento a 28ºC (temperatura cloacal de las hembras del mismo género), se evaluó la eficiencia de diluyentes que son empleados de manera rutinaria para preservar espermatozoides de mamíferos; se extrajo semen del género Crotalus de las especies atrox, basiliscus, culminatus, M. nigrescens, M. oaxacus, ravus, simus y scutulatus, se diluyeron los eyaculados en 10 μL de la solución correspondiente, se mantuvieron en tubos Eppendorf, en baño seco, y se evaluó la movilidad masal cada 30 minutos usando la escala de 0 a 5 antes mencionada (tabla 1; Fuentes-Mascorro y col., 2014); el tiempo más largo de conservación de la movilidad de los espermatozoides se presentó con el medio Tyrode modificado, que está constituido por el Tyrode comercial suplementado con albúmina bovina 5 mg/mL.

Tabla 1. Movilidad masal.Se evaluó con la escala de 0 a 5. En la fila superior se indica el diluyente y el tiempo en el que se terminó la evaluación, el número a la izquierda de la línea diagonal señala la movilidad inicial y el del lado derecho la movilidad final en el tiempo establecido en la primera fila.

Medidas de los espermatozoides. Se trabajó con tres ejemplares de vida libre: un Stenorrhina freminvillei, con un peso de 42 gramos y talla de 42.5 cm de largo total; un Coluber mentovarius, con un peso de 400 gramos y medida de 107.7 centímetros, y una Boa constrictor que pesaba 2,400 gramos y talla de 157 centímetros, los cuales fueron capturados por interacción con los humanos; el Crotalus molossus oaxacus, que se tomó del Herpetario Reptilium, ejemplar de 750 gramos, en cautiverio, con temperatura constante de 25 ºC y una humedad de 47 a 63%; se obtuvieron cinco eyaculados por ejemplar para la evaluación y se midieron 200 espermatozoides por cada uno con el programa motic 2.0, los resultados se muestran en la Tabla 2.

Tabla 2. Evaluación y medidas de los espermatozoides.Se emplearon cinco eyaculados por ejemplar. El índice morfo-espermático es el cociente del largo del flagelo entre el largo de la cabeza; %= porcentaje; epz = espermatozoides.

El ejemplar de Boa se encontraba al final de la estación reproductiva. Los índices morfo-espermáticos indican que los espermatozoides de cabezas pequeñas presentan rangos altos, como el caso de Stenorrhina, que es el de menor talla adulta, no encontrándose ninguna relación entre el largo adulto esperado de los géneros evaluados y el de los espermatozoides que producen.

5. Conclusión

El eyaculado de las serpientes surge en ondas, acompañadas de una fase de estimulación que continúa con la expulsión del esperma, el cual es expelido en volúmenes muy pequeños con una variedad de consistencia desde líquida hasta mucosa, de translúcido hasta blanco lechoso. Debido a que los hemipenes no presentan una función eyaculatoria, no es necesaria su eversión, pues el eyaculado es guiado a través del surco medio de los hemipenes. Evaluar el eyaculado mediante las técnicas rutinarias es posible ajustando la osmolaridad correspondiente a cada género y especie. El espermatozoide de los reptiles tiene una forma característica conservada y bajo las condiciones adecuadas de osmolaridad es posible mantenerlo viable en dilución para transportarlo.