Adenosina 3´,5´-monofosfato cíclico en la fisiología del espermatozoide del erizo de mar

Este trabajo fue apoyado por PAPIIT-UNAM (IN206016) y Conacyt Fronteras de la ciencia 71 (2016- 2018). Se agradece al Dr. Alberto Darszon la lectura crítica y el apoyo técnico del Biol. José Luis de la Vega Beltrán, M. en MM. Francisco Fabio Herrera Rodríguez, M. en C. Paulina Torres Rodríguez, Laboratorista J. Antonio Blancas Naranjo, Srio. Leonel Linares Labastida, y en Microscopía Confocal: Q.F.B. Xóchitl Alvarado Affantranger y M. en C. Andrés Saralegui Amaro.

1. Introducción

La concentración de AMPc en las células depende de la actividad de las adenilil ciclasas (ACs) (Cooper, 2003; Cooper y Crossthwaite, 2006; Hanoune y Defer, 2001), que lo sintetizan, y de las fosfodiesterasas (FDE) (revisado en Ahmad y col., 2015; Francis y col., 2011; Maurice y col., 2014), que lo hidrolizan. Este segundo mensajero puede actuar de manera directa uniéndose a canales iónicos (Kaupp y Seifert, 2001; Matsumoto y col., 2003; Santoro y col., 1998; Zufall y col., 1997), activando a la proteína intercambiadora de nucleótidos de guanina (Epac) (De Rooij y col.,1998), o de manera indirecta, mediante la proteína cinasa dependiente de AMPc (PKA) (Beavo y Brunton, 2002) que fosforila proteínas, regulando su actividad.

2. Las adenilil ciclasas (ACs)

Las ACs son enzimas con una distribución ubicua. En células somáticas de mamífero existen dos tipos de ACs: las de membrana (ACm) y la soluble (sAC). Hay nueve genes distintos que codifican para las ACm (ACm1-9), cuyo patrón de expresión y regulación es diferente en dichas células somáticas (Taussig y Gilman, 1995). Las ACm tienen como sustrato al MgATP y se regulan de manera diferencial por proteínas G, por forskolina –compuesto no fisiológico extraído de la planta Coleus forskohlii– (Hanoune y Defer, 2001), por cinasas (PKA y/o proteína cinasa estimulada por diacilglicerol (PKC) o por otras moléculas de señalización como el Ca2+ y la calmodulina (CaM). La sAC (Buck y col., 1999), descrita originalmente en extractos de testículo de rata (Braun y Dods, 1975), se estimula por bicarbonato y por Ca2+, pero a diferencia de las ACm, su sustrato es el MnATP (Chen, 2000; Jaiswal y Conti, 2003; Litvin y col., 2003; Zippin y col., 2003).

3. La actividad de AC en los espermatozoides de erizo de mar

La actividad de AC se estudió inicialmente en los espermatozoides de erizo de mar (eem) (Garbers y Kopf, 1980; Garbers, 1989; Kopf y Garbers, 1980), cuando se pensaba que sólo existían las ACm (Cooper, 2003; Cooper y Crossthwaite, 2006; Hanoune y Defer, 2001). En esa época se observó que los eem tenían una actividad de AC inusualmente alta, comparada con la de células somáticas (en Mourelle y col., 1984). Además, se encontró que tanto en este sistema (Garbers, 1981) como en espermatozoides de otras especies, la actividad dependiente de MnATP era mucho mayor que la dependiente de MgATP. Se sabe que en eem la actividad de AC se regula por proteínas G (Capasso y col., 1990), por pH y por Ca2+ (Bookbinder y col., 1990; Cook y Babcock, 1993; Kopf y Garbers, 1980; Mourelle y col., 1984; Watkins y col., 1978), así como por hiperpolarización de la membrana plasmática (Beltrán y col., 1996). Aunque la elevación en los niveles de AMPc inducida por hiperpolarización de los espermatozoides es independiente de Ca2+, es claro que dichos niveles aumentan en presencia de Ca2+ y que preceden a la reacción acrosomal (RA) (Beltrán y col., 1996), como se observó en cabezas aisladas de los espermatozoides (Garbers, 1981). Dado que dos componentes de la envoltura del óvulo hiperpolarizan a los espermatozoides, un polímero de fucosa sulfatada (FSP) y el decapéptido speract (GFDLNGGGVG, regulador de la movilidad del espermatozoide), se pensó que era posible que la activación de la AC participará en la regulación de la RA, la movilidad y la quimiotaxis del eem, como en mamíferos (Esposito y col., 2004; Spehr y col., 2003; Visconti y col., 1995).

4. La adenilil ciclasa soluble en los eem

La fuente más importante de AMPc (~94%) en el eem es la AC soluble (SUsAC, en Vacquier y col., 2014). Esta enzima purificada parcialmente (PM~190 kDa) de eem Strongylocentrotus purpuratus (Bookbinder y col., 1990) se clonó y secuenció de una biblioteca de testículos de la misma especie (SUsAC; Nomura y col., 2005). En espermatozoides de S. purpuratus, la enzima se distribuye a lo largo del mismo e incluye las áreas del acrosoma y de la mitocondria (Beltrán y col., 2007a; Bookbinder y col., 1990). La SUsAC, como la de mamífero (Chen, 2000; Jaiswal y Conti, 2003; Litvin y col., 2003), se estimula por bicarbonato, pero a diferencia de ésta, la de erizo de mar lo hace también por pH alcalino y no por Ca2+ (Nomura y col., 2005). A pesar de que la SUsAC tiene cinco sitios posibles de fosforilación por PKA y de que en condiciones in vitro se fosforila por PKA y se une a CaM-Agarosa (Bookbinder y col., 1990; Bookbinder y col., 1991), su actividad no se estimula por PKA ni por CaM (Nomura y col., 2005).

5. Las ACs de membrana (ACm) en el eem

El genoma del erizo S. purpuratus  contiene cinco isoformas predichas de las ACm (ACm1, XP_787811; ACm2, XP_780688; ACm3, XP_011667569.1; ACm5, XP_787809 y ACm9, XP_798394), de las cuales cuatro (ACm1 [fig. 1], ACm2, ACm5 y ACm9) se localizaron mediante experimentos de inmunofluorescencia (IF) distribuidas de manera diferencial en eem (Vacquier y col., 2014) y de “Western Blot” (WB) en membranas de cabeza o de flagelos aislados de los espermatozoides de la misma especie (Beltrán y col., 2007a). En el mismo trabajo demostramos de manera funcional que la actividad de AC de la fracción particulada (precipitado de 200,000 xg) de espermatozoides completos de S. purpuratus se estimula con NaF (que estimula proteínas G, las cuales modulan ACm) y por forskolina, que activa las isoformas de ACm1-8. También observamos que la estimulación con forskolina se previene por 2,5-dideoxiadenosina (DDA, inhibidor permeable de ACm). La estimulación de la actividad de AC por forskolina la encontramos en las membranas purificadas de flagelos de los espermatozoides, corroborando la presencia de ACm en los mismos (Beltrán y col., 2007a). Existen evidencias de la presencia de ACm tanto en eem Paracentrotus lividus (Capasso y col., 1990) como en mamíferos (Baxendale y Fraser, 2003; Leclerc y col., 1996; Liguori y col., 2004). Dado que la SUsAC del eem no se estimula por Ca2+ y que la única isoforma de las ACm que se encuentra específicamente en el área del acrosoma del eem es la ACm1 (fig. 1), cuyo ortólogo en mamífero pertenece al grupo I (ACm1, ACm3 and ACm8) de las estimulables por Ca2+ y CaM (revisado en Vacquier y col., 2014), es posible que la ACm1 sea la enzima responsable –al menos en parte– del aumento en los niveles de AMPc cuando los eem se hiperpolarizan en presencia de Ca2+ (Beltrán y col., 1996). Lo anterior respalda la participación de las ACm en la RA del eem.

Figura 1. La ACm1 localizada en el área del acrosoma del eem disminuye con la reacción acrosomal. A) Inmunofluorescencia (microscopía confocal) de los espermatozoides marcados con anti-ACm1 (rojo) y con anti-faloidina (verde, que se une a actina; Su et al., 2005) de espermatozoides control y de espermatozoides reaccionados. B). Los insertos en ambos casos (A y B) muestran la sobreposición del contraste de fases con la fluorescencia. Modificada de Romero, 2013.

6. El AMPc y la reacción acrosomal (RA)

El objetivo del espermatozoide es fecundar al óvulo y para lograrlo, la célula debe experimentar la reacción acrosomal (RA). Éste es un proceso complejo que tienen que realizar los espermatozoides de las especies con acrosoma (vesícula con pH acídico) para poder fecundar al óvulo homólogo, el cual se ha conservado desde los invertebrados marinos hasta los mamíferos y se compone de una serie de cambios morfológicos y fisiológicos. Los primeros consisten en la exocitosis de la vesícula acrosomal y de una polimerización de actina dependiente de pH intracelular (pHi) (Tilney y col., 1978), que conduce a la formación del túbulo acrosomal, exponiendo una nueva membrana cubierta por la proteína bindina que interactuará con el óvulo (Zigler y col., 2005). Fisiológicamente, la RA se induce de manera especie- específica por polímeros de fucosa sulfatados (PFS) de la cubierta de gelatina del óvulo (EJ) (Alves y col., 1997). En erizo de mar el PFS es el inductor natural de la RA, que al interactuar con el receptor de la gelatina (suREJ1) en la membrana plasmática del espermatozoide (Moy y col., 1996; SeGall y Lennarz, 1979; Vacquier y Moy, 1997), dispara cambios en el potencial de membrana (Em) dependientes de K+ y aumentos en el pHi y en la [Ca2+]i y de sodio ([Na+] i), así como en los niveles de AMPc, inositol 1,4,5-trifosfato (IP3) y de ácido nicotínico adenina dinucleótido fosfato (NAADP) (revisado en Darszon y col., 2011). La unión del PFS a su receptor también estimula las actividades de la óxido nítrico sintasa (NOS), la fosfolipasa D, la AC y la PKA, que a su vez fosforila proteínas (revisado en Neill y Vacquier, 2004).

En el laboratorio, la RA puede inducirse en los eem de manera natural con la envoltura (gelatina o “EJ”) del óvulo homólogo, o con el PFS (Hirohashi y col., 2008) contenido en ella. En este modelo (eem) la RA también se puede inducir artificialmente, ya sea aumentando el pH extracelular a 9.0, o mediante el ionóforos de Ca2+, A23187 o el antiportador K+/H+, nigericina (Hinkley y col., 1986; Kopf y Garbers, 1980), y todos elevan los niveles de AMPc dependiendo de Ca2+ externo (Garbers, 1989, revisado en Beltrán y col., 2007a; Neill y col., 2004). Las cabezas aisladas de eem contienen AC, PDE de AMPc, PKA, y CaM. Tanto en éstas (Garbers, 1981), como en las células intactas (Beltrán y col., 1996), los aumentos en AMPc preceden a los cambios morfológicos asociados a la RA, lo cual indica la participación del AMPc en aquella. Sin embargo, esta conclusión se tendrá que sustentar con experimentos de mejor resolución temporal.

Utilizando espermatozoides de S. purpuratus (Beltrán y col., 2007a) mostramos que su exposición a DDA inhibe en parte los aumentos de los niveles de AMPc (37%) y de RA (49%) inducidos con “EJ”, lo cual sugiere la participación de ACm en la RA (Beltrán y col., 2007a), como ocurre en espermatozoides de mamífero (Leclerc y col., 1996; Liguori y col., 2004; Livera y col., 2005; Wertheimer y col., 2013).

Es importante mencionar que los espermatozoides de ratón tienen actividad de AC que se estimula por forskolina de manera significativa, en comparación con la de ratones nulos en la ACm3, y que los resultados de experimentos de inmunofluorescencia muestran que dicha enzima se localiza en el área del acrosoma del espermatozoide (Livera y col., 2005) de manera similar a la ACm1 (fig. 1) en los eem (Beltrán y col., 2007a). Lo anterior, junto con el hecho de que ratones carentes del gen que codifica para la ACm3 son infértiles debido a que tienen disminuida la movilidad y la RA espontánea aumentada (Livera y col., 2005), insinúa que esta enzima participa en ambas funciones. De manera interesante, cuando los eem Lytechinus pictus se hiperpolarizan con gelatina (EJ; de -43.6±1.7 a -52.0±0.0 mV) o artificialmente diluyéndose en agua de mar carente de K+, pero conteniendo valinomicina (ionóforo de K+; -43.6±1.7 a -130.4±6.7 mV), los niveles de AMPc se estimulan 2.9 y 2.2 veces, respectivamente. No obstante, el aumento en los niveles de AMPc disminuye de 2.2 a sólo 1.9 cuando se elimina el Ca2+ del agua de mar carente de K+ (Beltrán y col., 1996). Además, los resultados de experimentos de doble tinción por inmunofluorescencia (fig. 1), con anti-ACm1 y anti-faloidina acoplada a Alexa 495 que marca actina (indicador de RA en eem; Su y col., 2005), muestran que cuando se induce la RA, la señal de fluorescencia correspondiente a la ACm1 mengua, corroborando la presencia de ACm1 en el área del acrosoma del eem (Romero, 2013). Lo anterior, aunado al hecho de que la ACm1 pertenece –como ya mencionamos– al grupo de las ACm estimulables por Ca2+ y CaM (revisado en Vacquier y col., 2014), indica fuertemente que la ACm1 podría participar en la RA del eem, como se sugirió en espermatozoides de ratón. Está reportado que la reactividad de Gs se pierde en los espermatozoides reaccionados de ratón (Wertheimer y col., 2013), lo cual es consistente con la localización en el área del acrosoma de ambas proteínas, ACm1 y Gs.

7. El AMPc y la movilidad de los espermatozoides

Desde la década de los 80 se consideró que el AMPc regulaba la movilidad en un modelo de eem permeabilizados con el detergente Tritón X-100 (Murofushi y col., 1986; Tash, 1989; Tash y col., 1986; Tash y Means, 1983). Los eem están inmóviles en las gónadas debido a un bajo pH por la alta concentración de CO2. Cuando los espermatozoides se liberan al agua de mar, cuyo pH es de 8.0, hay un eflujo de H+ aumentando el pH de 7.2 a 7.6 (Lee y col., 1983). Este incremento activa tanto a la SUsAC (Nomura y col., 2005), como a las dineinas, ATPasas que se accionan con pH alcalino (7.5-8.0) (Christen y col., 1983) y principales consumidoras de ATP que se sintetiza en la única mitocondria del espermatozoide (fig. 2). De lo anterior se concluye que la movilidad y la respiración están vinculadas por la regulación del pHi (Christen y col., 1982; Shapiro y col., 1985). Como el intercambiador Na+/H+ específico del espermatozoide (sNHE) se puede activar por la hiperpolarización del espermatozoide (Lee, 1984 y 1985), es posible que la estimulación de la actividad de AC por hiperpolarización (Beltrán y col., 1996) esté mediada por el aumento de pHi ocasionado al activarse el sNHE, que tiene un dominio sensor de voltaje (Wang y col., 2003).

El speract es el primer péptido activador de los espermatozoides (SAP, revisado en Beltrán y col., 2007; Darszon y col., 2008; Darszon y col., 2011; Nishigaki y col., 2014; Suzuki, 1995), que se purificó y caracterizó de la cubierta de óvulos de S. purpuratus, L. pictus y Hemicentrotus pulcherrimus (Hansbrough y Garbers, 1981; Suzuki y col., 1981). Concentraciones picomolares de este SAP incentivan la movilidad, la respiración y el metabolismo de fosfolípidos de los espermatozoides (Hansbrough y col., 1980; Harumi y col., 1992), además de inducir aumentos en los niveles de GMPc y AMPc (Kopf y col., 1979). Los niveles de ambos nucleótidos los determinan las actividades de guanilil ciclasa (GC) y adenilil ciclasa (AC) que los sintetizan, respectivamente, y las fosfodiesterasas (FDE), que los hidroliza. Aunque inicialmente se reportó que la actividad de FDE se restringe a los flagelos (Sano, 1976; Toowicharanont y Shapiro, 1988), es poco probable que eso sea así, ya que también la cabeza tiene actividad de AC (Garbers, 1981). Es posible que la actividad a la que se refieren los trabajos anteriores corresponda a la FDE5, la cual es específica para GMPc (producido por la GC), que sí se localiza sólo en el flagelo del espermatozoide. Sabemos que el flagelo de espermatozoides de S. purpuratus contiene tanto la SUsAC como al menos 2 ACm: la ACm2 y la ACm9 (Beltrán y col., 2007a; Vacquier y col., 2014), y que en la movilidad de los espermatozoides de esta especie participa principalmente la actividad de sAC (Vacquier y col., 2014). Como ya mencionamos, de las nueve isoformas de las ACm descritas en células somáticas (Hanoune y Defer, 2001), al menos cuatro están en el eem de S. purpuratus, de las cuales la ACm2 y la ACm9 tienen una distribución parecida a la SUsAC que incluye al flagelo (Beltrán y col., 2007a; Vacquier y col., 2014). Además, la DDA (inhibidor permeable con IC50 de 45 μM que se une de manera no competitiva al sitio P de las ACm; Schuh y col., 2006) modifica el patrón de nado de los espermatozoides de L. pictus (Loza-Huerta, 2007). Los resultados de experimentos en que los eem de S. purpuratus se pre-incubaron durante 30 minutos con concentraciones de 75-300 μM de DDA, mostraron que dicho inhibidor no afecta la velocidad de nado circular de los espermatozoides (Loza-Huerta, 2013). Por el contrario, la incubación de los espermatozoides de la misma especie durante 10 minutos con SQ22536 (otro inhibidor de las ACm con IC50 de 200 μM e igual mecanismo de acción que la DDA; Schuh y col., 2006) inhibe poco, pero significativamente (1 mM ~25% y 2 mM ~30%), la velocidad de nado circular de las células. Lo anterior junto con el hecho de que la ACm2 se regula por PKC (Cooper, 2003; Cooper y Crossthwaite, 2006; Hanoune y Defer, 2001, revisado en Vacquier y col., 2014), que la movilidad del espermatozoide es sensible también a inhibidores de PKC (White y col., 2007) y que el flagelo del eem contiene sustratos fosforilados por PKC (Loza-Huerta y col., 2013), sugiere la participación de la actividad de ACm en la movilidad. Es importante considerar que el efecto de inhibidores de ACm y de PKC sólo se evaluó en la velocidad de nado circular (Loza-Huerta, 2013) y que el espermatozoide tiene al menos tres tipos de movilidad (circular, vibratorio y rectilíneo; Loza-Huerta, 2007). Como mencionamos en la sección anterior, los ratones nulos en ACm3 son subfértiles y sus espermatozoides tienen disminuida la movilidad (Livera y col., 2005), lo cual apoya la participación de ACm en la movilidad de los eem.

7.1 El AMPc y la quimiotaxis de los espermatozoides

El erizo de mar es el primer modelo animal en el cual se documentó el fenómeno de la quimiotaxis (Lillie, 1912), la capacidad de los espermatozoides para nadar hacia los óvulos en respuesta a señales químicas (Darszon y col., 2008; Hussain y col., 2016; Kaupp y Álvarez, 2016; Miller, 1985; Yoshida y Yoshida, 2011). En este modelo, los espermatozoides son atraídos al óvulo por péptidos activadores (SAPs), los cuales difunden de la envoltura de gelatina del óvulo (revisado en Darszon y col., 2008; Nishigaki y col., 2014; Suzuki, 1995). En Arbacia punctulata (Kopf y col., 1979; Suzuki y col., 1984; Ward y col., 1985) y L. pictus (Guerrero y col., 2010; Hansbrough y Garbers, 1981; Kopf y col., 1979) resact y speract, respectivamente, son los dos SAPs mejor caracterizados con propiedades quimioatrayentes y esta propiedad, como la RA, depende de Ca2+. El speract induce fluctuaciones de Ca2+ en los flagelos de espermatozoides de S. purpuratus (Kaupp y col., 2003) y de L. pictus (Granados-González y col., 2005), las cuales también se han observado en A. punctulata y en la estrella de mar Asterias amurensis, en respuesta a sus respectivos quimioatrayentes, resact y asterosap (Bohmer y col., 2005). En poblaciones de espermatozoides de A. punctulata, resact induce un aumento de Ca2+ bifásico, de los cuales el primero está mediado por GMPc y el segundo por AMPc (Kaupp y col., 2003). En el mismo trabajo, pero utilizando células individuales, mostraron que las espigas de Ca2+ en los flagelos provocan que los espermatozoides giren (Kaupp y col., 2003) y sugirieron que tanto el aumento en AMPc como el segundo aumento en el Ca2+ podrían estar involucrados en la adaptación de los espermatozoides al quimioatrayente (Kaupp y col., 2003).

Se ha propuesto que CatSper (el canal iónico específico del espermatozoide) media la afluencia de Ca2+ evocada por el quimioatrayente y controla la dirección quimiotáctica; así como que la alcalinización concomitante producida por speract funciona como un mecanismo cooperativo que le permite a CatSper transformar los cambios periódicos de voltaje en ráfagas de Ca2+ (Espinal-Enríquez, y col., 2017; Seifert y col., 2015).

Además, como ya mencionamos, el aumento de pH disparado por speract también estimula a la SUsAC, aumentando los niveles de AMPc, que a su vez regulan a CatSper. Debido a lo anterior, se esperaría que los inhibidores de la sAC y/o ACm actuarán de igual forma al menos parcialmente en la quimiotaxis. En Ciona intestinalis los resultados de experimentos con KH7 sugieren que la sAC participa en la frecuencia del batido flagelar y la quimiotaxis dependiente del factor del óvulo, SAAF o factor activador y atrayente del espermatozoide (Shiba e Inaba, 2014).

7.2 La vía de señalización del speract

Con base en los resultados de experimentos hechos a lo largo de más de 35 años por diferentes grupos (revisado en Espinal-Enríquez y col., 2017; García-Rincón y col., 2016), el modelo propuesto para la vía de señalización disparada por el speract es la siguiente: la unión del speract a su receptor (Cardullo y col., 1994), acoplado a la guanilil ciclasa (GC) en la membrana del flagelo del espermatozoide, eleva los niveles de GMPc, que abre el canal iónico de K+ Tetra-KCNG, produciendo una salida de K+ y una hiperpolarización (el Em disminuye, es decir, se hace más negativo) transitoria del espermatozoide (Galindo y col., 2000; Lee y Garbers, 1986). Dicha hiperpolarización activa al intercambiador Na+/H+, elevando el pHi (Lee, 1985; revisado en Nishigaki y col., 2014), lo cual estimula la AC soluble (SUsAC) y aumenta los niveles de cAMP (revisado en Vacquier y col., 2014), la ATPasa dineína (Christen y col., 1983), la carnitina palmitoil transferasa I (CPT-I, asociada a la membrana externa de la mitocondria (Bezaire y col., 2004), el canal de Ca2+ específico del espermatozoide, CatSper (el más complejo de los canales iónicos conocidos y cuya ausencia causa infertilidad en ratones) (Chung y col., 2017; Espinal-Enríquez y col., 2017; Ren y col., 2001; Seifert y col., 2015) y la fosfolipasa A2 (PLA2; Mita y col., 1991; Mita y Ueta, 1990) para alimentar la -oxidación (Eaton y col., 1996) y aumentar los ácidos grasos libres (FFA, Jezek y col., 1998) que entran a la mitocondria, respectivamente. Lo anterior incrementa los niveles de NADH que transfiere sus electrones a la cadena de transporte de electrones (CTE), estimulando el consumo de oxígeno y generando el cambio en el potencial de membrana mitocondrial (Emit, fig. 2) utilizado por la F0F1-ATP sintasa para la síntesis de ATP. La hiperpolarización inicial disparada por el speract y el aumento en los niveles de AMPc sintetizado por la SUsAC abre el canal de Na+, SpHCN produciendo una entrada de Na+ y una despolarización del espermatozoide. Esta despolarización, junto con los aumentos en AMPc, activa el canal CatSper que induce oscilaciones de Ca2+ en el flagelo de la célula. Finalmente, las dineinas hidrolizan el ATP en concierto con las oscilaciones de [Ca2+] para regular el nado del espermatozoide (la movilidad y la quimiotaxis) (modificado de García-Rincón y col., 2016).

Figura 2. La rodamina-123 marca la mitocondria de los espermatozoides de S. purpuratus. Espermatozoides marcados con 10 μM de Rodamina-123. A) Distribución de la fluorescencia observada en microscopio confocal. B) Sobreposición de la fluorescencia con las imágenes de contraste de fases observadas con un objetivo de 100x. Modificada de García-Rincón, 2016.

El uso del inhibidor específico de la sAC, KH7, nos permitió demostrar que dicha enzima participa de manera importante en la movilidad de los eem (Vacquier y col., 2014). Estos resultados concuerdan con el hecho de que los espermatozoides de ratones nulos para la sAC no fecundan a los óvulos in vitro debido a que las células no se mueven (Esposito y col., 2004). Además, el espermatozoide inmóvil recupera la movilidad cuando se expone a análogos permeables de AMPc (Wang y col., 2003), confirmando que la sAC está involucrada en la generación del AMPc necesario para la movilidad de los espermatozoides de ratón. También en C. intestinalis existe evidencia funcional de la participación de ACm en la activación de la movilidad flagelar basal mediada por PKA (Shiba e Inaba, 2014).

8. El AMPc y la fosforilación de proteínas dependiente de PKA en la movilidad y en la RA del eem

La fosforilación reversible de proteínas es una modificación pos-transduccional reconocida como el mecanismo principal para el control de eventos intracelulares en células eucariotas, y en el espermatozoide se ha propuesto como un mecanismo de regulación de gran importancia en la bioenergética mitocondrial (Mizrahi y Breitbart, 2014). Como se mencionó antes, uno de los blancos principales del AMPc es la proteína cinasa dependiente de AMPc o “PKA”, que fosforila proteínas y regula su actividad. En células eucariotas, la PKA es una de las primeras cinasas descubiertas y mejor caracterizadas (Walsh y col., 1968), y es un heterotetrámero compuesto por dos subunidades regulatorias (R) y dos catalíticas (C), con cuatro tipos diferentes de subunidades R (RI, RI, RIIy RII) y cuatro tipos diferentes de subunidades C (C, C, Cy PrKX) (Taylor y col., 2004; Zimmermann y col., 1999).

La PKA fue la primera proteína cinasa que se identificó en eem (Garbers y Kopf, 1980; Garbers y col., 1980; Lee y Iverson, 1976) y desde esa época se sabe que cuando la concentración de AMPc aumenta, la PKA se activa, ciertas proteínas del axonema del flagelo se fosforilan y se inicia la movilidad flagelar, la cual se mantiene hasta que el espermatozoide se fusiona con el óvulo (Garbers y Kopf, 1980; Garbers, 1989).

Se ha propuesto que cambios en el estado de fosforilación de las ~250 proteínas que conforman el axonema (Inaba, 2003) regulan la movilidad de los espermatozoides, debido a aumentos en los niveles de AMPc y de calcio (Tash, 1989, revisado en Darszon y col., 2008), aunque muy pocas se han identificado a nivel molecular.

En eem, la PKA (fig. 3 y González-Mora, 2016), como las ACs (Beltrán y col., 2007a; Vacquier y col., 2014), se distribuyen a lo largo del espermatozoide. En este modelo inicialmente encontraron que la axoquinina (proteína del axonema del flagelo) se fosforila de manera dependiente de los niveles de AMPc cuando la movilidad de los espermatozoides se activa con ATP (Tash y col., 1986). También identificaron una RII de la PKA (Paupard y col., 1988) y a CaM (Tash y Means, 1982) como proteínas fosforiladas asociadas a la movilidad de los espermatozoides. Posteriormente, la exposición de los espermatozoides intactos a diferentes condiciones iónicas para mantenerlos inmóviles o móviles, permitió observar que la activación de la movilidad aumentaba la fosforilación de sólo cuatro proteínas del flagelo (32, 45, 130 y 500 kDa), las cuales podrían ser subunidades de la ATPasa dineína, considerando sus propiedades de solubilidad (Bracho y col.,1998).

El aumento en el pHi, disparado por la unión del speract a su receptor, inactiva a la GC defosforilando su sitio catalítico (Ward y col., 1985) y aumenta la actividad de FDE5 (Su y Vacquier, 2006), la cual es accionada por GMPc (Rybalkin y col., 2003), así como por fosforilación mediada por PKA cuando los eem se exponen a EJ, inductor natural de la RA (Su y Vacquier, 2006).

Existen evidencias de que los canales de Ca2+ regulados por voltaje (Cav) también se controlan por fosforilación mediada por diferentes cinasas (revisado en Darszon y col., 2011), entre las que se encuentra la PKA (Catterall, 2016). El uso de anticuerpos comerciales contra Cavs de rata (anti-CavPan, anti-Cav1.2 y anti-Cav2.3) y experimentos de inmunofluorescencia nos permitieron demostrar que los Cav1.2 y Cav2.3 se encuentran distribuidos diferencialmente en los flagelos y en las áreas de la mitocondria y del acrosoma de eem S. purpuratus (Granados- González y col., 2005). Con los mismos anticuerpos y experimentos de WB corroboramos que dichos canales están en las membranas de flagelo de los espermatozoides; además, advertimos que los antagonistas de canales Cav, nifedipina y nimodipina, que inhiben la RA, reducen el aumento intracelular de Ca2+ inducido por una despolarización provocada por K+ en espermatozoides de L. pictus tratados con el ionóforo de K+, valinomicina. Lo anterior sugiere que los canales Cav1.2 y Cav2.3 podrían participar en la RA y/o en la movilidad del eem (Granados-González y col., 2005). Está reportado que la inducción de la RA de los eem con EJ incrementa la actividad de AC, de AMPc y de fosforilación mediada por la PKA (Su y col., 2005). En ese trabajo, el uso del inhibidor de PKA, H89, de un análogo permeable de AMPc y del inhibidor de FDEs, IBMX, hizo posible demostrar que la PKA es necesaria para que la RA se lleve a cabo. Estos resultados concuerdan con la distribución de la PKA en los eem que, a diferencia de lo reportado para los espermatozoides de ratón (Wertheimer y col., 2013), también se encuentra en la cabeza (fig. 3). Además, mediante un anticuerpo que detecta sustratos fosforilados por PKA (anti-PKAs) y espectroscopía de masas (MS/MS), reconocieron seis proteínas fosforiladas por dicha enzima al exponer a los espermatozoides a EJ, entre las que se encuentran la PDE5 (específica para GMPc) y/o PDE11, que degrada tanto AMPc como GMPc. Sabemos que el AMPc está involucrado en todas las funciones importantes del eem, como la movilidad, la quimiotaxis y la RA, y que el GMPc participa en la movilidad y en la quimiotaxis de esta célula. También identificaron una adenilato quinasa (AK), que puede ser la AK1 o la AK5. La actina fue otra de las proteínas identificadas, que sabemos se polimeriza durante la RA. Otra proteína encontrada fue la creatina cinasa (CK), proteína estructural unida tanto a la membrana del flagelo como al axonema, y en eem existe la hipótesis de que participa en una lanzadera de fosfo-creatina, re-fosforilando el ADP producido por las dineinas para restablecer el ATP. De hecho, en eem, este es el mecanismo propuesto para el transporte del ATP, 40 μm desde la mitocondria (fig. 2), donde se produce hasta el final del flagelo (Wothe y col., 1990). Finalmente, también identificaron a EPS8, substrato de la vía del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGF) (Su y col., 2005).

Figura 3. La PKA se distribuye a lo largo del espermatozoide e incluye las áreas de la mitocondria y del acrosoma. (A) Distribución de la fluorescencia de la PKA (anti- PKA; 1:100) en el eem. (A’) sobreposición de la fluorescencia con luz blanca de los espermatozoides observados en microscopio confocal invertido Olympus FV1000 2P con un objetivo de 60x. (B y B´) son los eem incubados sólo con el anticuerpo secundario, (A´1) es la fluorescencia del espermatozoide indicado en (A’) amplificado y (A´2) es la sobreposición de la fluorescencia con luz blanca del mismo espermatozoide. En todos los paneles la escala representa 10 μm. Modificada de González-Mora, 2016.

Más recientemente demostramos que existe una fosforilación diferencial de algunos sustratos de PKA y de PKC asociados a las BL aisladas (ver proteínas identificadas en sección 9.2. Las balsas lipídicas [BL] en los eem), a partir de espermatozoides de S. purpuratus en diferentes condiciones de movilidad: inmóviles, móviles y estimulados por speract (Loza-Huerta y col., 2013). Lo anterior sugiere que algunas proteínas mitocondriales reguladas por PKA y por PKC pueden influir en la movilidad del eem (Loza-Huerta y col., 2013). Estos resultados concuerdan con el hecho de que la unión del speract a su receptor despolariza la mitocondria del espermatozoide mediante el aumento de pH disparado por el péptido, lo cual, junto con el incremento de Ca2+, modula el metabolismo mitocondrial para regular la movilidad (García-Rincón y col., 2016).

8.1 La PKA y las AKAPs

Diferentes proteínas de andamiaje para cinasas A (AKAPs) tienen una función dual, como anclas de PKA a diferentes ubicaciones subcelulares cercanas a los sustratos de PKA para fosforilarlos selectivamente, y cómo andamios para los señalosomas con proporciones diferentes de PKA, ACs, fosfatasas, otras cinasas, Epac, PDEs y CaM, entre otras proteínas efectoras (Aggarwal-Howarth y Scott, 2017; Maurice y col., 2014; Scott y McCartney, 1994). Los señalosomas son complejos de señalización/regulación multimoleculares localizados en sitios intracelulares específicos que agrupan moléculas de señalización, reguladoras y efectoras, donde facilitan la compartimentalización de vías de señalización de nucleótidos cíclicos y funciones celulares específicas (Ahmad y col., 2015; Monterisi y Zaccolo, 2017). En el espermatozoide la localización de las AKAPs es crítica, dado que es una célula altamente compartimentalizada, donde participan en la movilidad, la capacitación y la RA (Carr y Newell, 2007; Vizel y col., 2015). En este sistema se han detectado diferentes AKAPs, entre las que se encuentran AKAP1 –inicialmente llamada AKAP8- que ancla a PKAIIa las mitocondrias en el flagelo del espermatozoide; AKAP3 (Amaral y col., 2014; Vizel y col., 2015), también llamada AKAP110 (Carr y col., 2001); AKAP4 o AKAP82 (Ben-Navi y col., 2016); AKAP8, que ancla PKA al núcleo del espermatozoide AKAP11; AKAP220, MAP2 otra AKAP que participa en la regulación de capacitación y/o la reacción acrosomal (revisado en Carr y Newell, 2007), y RSP3 (AKAP, llamada así por sus siglas en inglés para radial spoke protein; Gaillard y col., 2001; Smith y Yang, 2004).

Mediante análisis proteómico (MS/MS) de solubilizados de espermatozoides de S. purpuratus pasados por una columna de Co2+ o por columnas de afinidad de lectinas (concanavalina A o aglutinina de germen de trigo (WGA) unidas a agarosa, identificamos 6, 11 y 12 péptidos únicos, respectivamente, de la proteína SpRSP (gi|2905895; 63kDa) del axonema (Beltrán, inédito). Además, en una banda de proteína de una muestra de flagelos separada en un mini gel desnaturalizante de poliacrilamida-dodecilsulfato de sodio (PA-SDS) en la cual se detectó la PKA mediante WB, se identificaron por MS/ MS 13 péptidos únicos de SpRSPl (gi|780158049; 31 kDa) y 11 de SpRSP9 (gi|115733045) (González-Mora, 2016). En la misma banda detectada con anti-PKA, pero en un experimento diferente, también identificamos cinco péptidos únicos de la isoforma X1 de SpRSP3 (gi|72009354; 45 kDa), la cual tiene alta identidad (67%) y homología (84%) con la AKAP de espermatozoides de humano (Q86UC2; RSPH3_ HUMAN), que corresponde a AKAP4 (González-Mora, 2016).

En espermatozoides de mamífero se ha propuesto que AKAP110 podría actuar como andamio de la fosfatasa PP1 de Serina/Treonina y de Rho, una proteína G pequeña, así como de su efector RHOK (cinasa de Serina/Treonina) (Carr y col., 2001). También mediante análisis proteómico (MS/MS) de muestras de eem S. purpuratus identificamos a la PP1 (Beltrán, inédito), y está reportado que tanto Rho (que regula procesos celulares basados en actina), como su efector RHOK, participan en la RA del eem (Castellano y col., 1997; Urióstegui y col., 2007). Lo anterior sugiere la participación de AKAPs en el eem. Existe un modelo donde proponen que el par central de microtúbulos del axonema distribuye las señales químicas a RSP, los cuales modifican el estado de fosforilación de las proteínas del axonema para activar/inactivar brazos de dineina particulares que promuevan un deslizamiento coordinado de los microtúbulos en el axonema (revisado en Yoshimura y col., 2007).

9. Las ACs en plataformas de señalización/balsas lipídicas

9.1 Las balsas lipídicas (BL)

Los microdominios en membranas nativas, también conocidos como BL o “Lipid Rafts”, “LD-DIM” (membranas de baja densidad insoluble en detergente), DRM (membranas resistentes a detergentes) o DIGs (dominios insolubles en detergentes ricos en glicolípidos, por sus siglas en inglés), se definen como plataformas de señalización enriquecidas en esfingolípidos, colesterol y proteínas de señalización resistentes a la extracción con detergentes no iónicos en frío (Pike, 2004). Las balsas lipídicas (BL) son microdominios lineales (200-500 nm; Gheber y Edidin, 1999) que incluyen a las caveolas, invaginaciones de la membrana plasmática (50-100 nm) en forma de matraz enriquecidas con la proteína caveolina, una proteína de andamiaje (Lisanti y col., 2004; Martens y col., 2000; Zheng y col., 2008).

Por muchos años la existencia de las BL ha sido un punto de controversia en términos de tamaño, estabilidad e importancia fisiológica (Edidin, 2003; Munro, 2003). Sin embargo, el uso de diferentes estrategias como técnicas bioquímicas, sondas fluorescentes, visualización por microscopía, enfoques funcionales (como la investigación del efecto de la destrucción de las BL en la función, por ejemplo, de canales iónicos; revisado en Dart, 2010), la aparente habilidad de dichos microdominios para agregar selectivamente moléculas de señalización que interactúan entre sí y la implicación de que podrían estar involucrados en la organización espacio-temporal de vías de señalización celulares (Patel y col., 2008; Simons y Toomre, 2000), son evidencia de que dichos microdominios existen y que son esenciales en la fisiología de las células.

9.2 Las BL en los eem

En los eem de tres especies (H. pulcherrimus, S. purpuratus y Anthocidaris crassispina) se aislaron y caracterizaron por primera vez BL de un gameto (Ohta y col., 1999). Esto se hizo solubilizando los espermatozoides con 1% de Triton-X100 a 4° y separando la BL en un gradiente de sacarosa (Ohta y col., 1999). Posteriormente también Ohta y colaboradores (Ohta y col., 2000), mediante experimentos de “Western blot” (WB), identificaron en las BL de eem S. purpuratus el receptor del speract, el receptor de la gelatina (SuREJ1), una proteína de 63 kDa (anclada a glucosil-fosfatidil inositol- GPI, marcador de BL), la subunidad de la proteína G heterotrimérica estimulatoria (Gs), la adenil ciclasa (que, como se supo posteriormente, corresponde a la sAC; revisado en Vacquier y col., 2014), la guanil ciclasa (GC) y la PKA. Además, como observaron que el receptor del speract, la proteína de 63 kDa anclada a GPI y la Gsco-inmunoprecipitan, propusieron que dicha BL podría ser el sitio de interacción del speract con su receptor, así como de la vía de señalización subsecuente involucrada en la inducción de la respiración, la movilidad y posiblemente en la reacción acrosomal del eem (Ohta y col., 2000).

Los flujos iónicos son esenciales en la fisiología del espermatozoide y existen evidencias de que las BL regulan la función de canales iónicos de diferentes maneras, ya sea por interacciones directas proteína-lípido o alterando las propiedades físicas de la bicapa lipídica (Dart, 2010). Dado que hay controversia respecto de la existencia de BL y se ha sugerido que dichas balsas podrían ser artefactos de la solubilización con detergentes (Chamberlain, 2004), Esperanza Mata-Martínez (2010) en su tesis de licenciatura se dio a la tarea de obtener BL por tres estrategias diferentes (detergente no iónico, sonicación y sonicación/pH alcalino) y mediante experimentos de WB, confirmando en ellas la presencia de la Gs, la PKA y la SUsAC. Además, demostró que dichas BL también contienen dos isoformas de adenilil ciclasas transmembranales (ACm2 y ACm9), los canales iónicos TetraKCNG, Cav1.2 y SpHCN y la flotilina 2, proteína de 45 kDa y marcador de BL, que puede estar o no en caveolas (Banning y col., 2011). En las BL del eem obtenidas solubilizando con 1% de Triton X100 no se encontró caveolina, aunque sabemos que el espermatozoide de esta especie la contiene (Mata-Martínez, 2010). Existe evidencia (bioquímica, de microscopía y funcional) de que prácticamente todos los tipos de canales iónicos están asociados a BL (Martens y col., 2000, revisado en Dart, 2010), lo cual apoya nuestros resultados. Posteriormente Miriam Cerrillos, en su tesis de licenciatura (Romero, 2013), demostró que las BL de flagelos aislados también contienen ACm2 y ACm9, confirmando la presencia de dichas enzimas en el flagelo, como lo muestran experimentos de inmunofluorescencia (Beltrán y col., 2007a). En el mismo trabajo se mostró que la desestabilización de las balsas lipídicas de eem S. purpuratus con el desensamblador de BL, metil--ciclodextrina (MC), inhibe ~90% la reacción acrosomal (RA) y estimula ~20% la movilidad de los espermatozoides (Romero, 2013). El hecho de que las BL de C. intestinalis participan en la señalización de Ca2+, responsable de la activación de la movilidad y de la quimiotaxis del espermatozoide (Zhu e Inaba, 2011), apoya los resultados en eem.

Como mencionamos en la sección VIII, buscando proteínas cuyo patrón de fosforilación cambia con la movilidad del espermatozoide, se aislaron BL de eem inmóviles, móviles y estimulados con el regulador de la movilidad speract (Loza-Huerta y col., 2013). Las proteínas se separaron en mini geles de dos dimensiones (2-D) y mediante WB se analizaron las proteínas con anticuerpos específicos contra sustratos fosforilados por PKA (anti-sPKA) o por PKC (anti-sPKC) para su identificación a nivel molecular por espectroscopía de masas (MS/MS) (Loza-Huerta y col., 2013). Lo anterior se hizo en BL derivadas, tanto de células completas como de flagelos aislados. Es interesante que en el primer caso (BL de eem) sólo una mancha detectada con anti-sPKA y 3 con anti-sPKC cambiaron el nivel de fosforilación con la movilidad y que en la mancha detectada con anti-sPKA (tabla 1) se identificaran principalmente proteínas mitocondriales: ATP- sintasa, creatina cinasa, NADH deshidrogenasa (ubiquinona), flavoproteína 2, succinil-CoA ligasa y el canal aniónico dependiente de voltaje 2 (VDAC- 2), además de las proteínas PKA RII, la cadena de la tubulina y la actina Cy I (tabla 1 y Loza-Huerta y col., 2013). Por el contrario, en las BL derivadas de los flagelos aislados se detectaron 16 manchas con anti- sPKA (tabla 2), de las cuales se identificaron 22 sustratos (tabla 2) y sólo una mancha con anti-sPKC (Loza-Huerta, 2013). Entre los sustratos de PKA identificados están el receptor del speract, la FDE5, la fosfatasa 1A (PP1A), la PKA RII, la flotilina (marcador de BL) y proteínas del axonema, entre otras (tabla 2). Este trabajo sugiere que la SUsAC, la PKA y la PKC participan en la movilidad de los eem cambiando los niveles de fosforilación de algunas proteínas y que la PKA y la PKC muestran una comunicación cruzada en este evento (Loza-Huerta, 2013). Interesantemente, mediante análisis proteómico (MS/MS) de una banda de proteína de muestra de flagelos detectada con anti-SUsAC (Mr ~190 kDa), identificamos 57 péptidos únicos del canal iónico tetraKCNG (gi|126506318), tres de la FDE de GMPc (gi|780164106), siete de CatSper (gi|780129264) y dos del canal SpHCN (gi|74136757), lo cual sugiere que la SUsAC interactúa de manera directa o indirecta con alguna(s) de éstas en la membrana del eem, confirmando los resultados obtenidos en BL de dicho espermatozoide (Beltrán, inédito). Además, en otra banda de proteína de la misma muestra de flagelos, pero detectada con anti-PKA, encontramos 10, nueve y seis péptidos únicos de la fosfatasa Ser/Treo PP1 (gi|780178928), en tres preparaciones diferentes, respectivamente, y en una de las preparaciones mencionadas seis péptidos únicos de la fosfatasa PPA2 (gi|115675671) (Beltrán, inédito). Estos resultados contribuyen de manera relevante a entender cómo se regula la movilidad de los eem. El hecho de haber identificado proteínas mitocondriales como sustratos de PKA y de PKC confirma la participación de este organelo en la fecundación (Ardón y col., 2009; García-Rincón y col., 2016). También se han descrito BL en espermatozoides de mamífero (Treviño y col., 2001) y se les ha implicado en la capacitación (Cross, 2004; Sleight y col., 2005; Travis y col., 2001) y en la interacción espermatozoide-zona pelúcida del óvulo (Miranda y col., 2009; Zitranski y col., 2010).

Tabla 1. Sustratos de PKA en BL de espermatozoides de S. purpuratus, cuyo patrón de fosforilación cambia con la movilidad.

Proteínas identificadas por MS/MS en una mancha detectada en geles 2-D mediante experimentos de WB con el anticuerpo anti-PKAs. NPT: Número de péptidos totales; NPU: Número de péptidos únicos. Modificada de Loza-Huerta, 2013.

Tabla 2. Sustratos de PKA en BL de flagelos aislados de espermatozoides de S. purpuratus, cuyo patrón de fosforilación cambia con la movilidad.

9.3 El speract modifica el patrón de fosforilación de sustratos de PKA y/o de PKC en BL de eem

Como recordaremos, el receptor del speract está acoplado a una guanilil ciclasa de membrana (GCm) en el flagelo del espermatozoide, cuya actividad se regula tanto por cambios en su estado de fosforilación como de pHi inducidos por la unión del speract a su receptor (Bentley y col., 1986; Ramarao y Garbers, 1985; Suzuki y Garbers, 1984; Ward y col., 1985). Para investigar si el speract provoca cambios en la fosforilación de otras proteínas, además de la GCm, en condiciones parecidas a las fisiológicas, los eem se expusieron durante 10 segundos a diferentes concentraciones (0.1, 1 y 10 nM) de speract en el agua de mar (Loza-Huerta, 2013). El análisis de las proteínas de los espermatozoides expuestos a dichas condiciones mediante experimentos de WB y anticuerpos específicos anti- PKAs o anti-PKCs, que detectan sustratos fosforilados por PKA o PKC respectivamente, mostró que en condiciones basales de movilidad, la PKA fosforila seis sustratos con una PM de ~180, 120, 80, 70, 50 y 45 kDa, y que la estimulación con speract modifica de manera diferencial los patrones de fosforilación de dichas proteínas. En general se observó una disminución en la fosforilación de los sustratos de PKA, excepto en las bandas de 120 y 80 kDa, cuya fosforilación aumentó con 10 nM de speract y la de 45 kDa que aumentó con 1 nM de speract. De manera similar, el speract también modificó el grado de fosforilación de diferentes sustratos de PKC (Loza- Huerta, 2013). Los resultados anteriores sugieren que durante el nado de los espermatozoides hacia el óvulo, el gradiente de speract modifica de manera dosis-dependiente la fosforilación de los sustratos de PKA y de PKC. Un análisis in silico, mediante el programa NetPhosK, indica que la mayoría de las proteínas que participan en la cascada de señalización del speract tienen sitios posibles de fosforilación tanto por la PKA (GCm, FDE específica para GMPc, tetraKCNG, Cav [Catterall, 2016], ACm6, SUsAC y SpHCN), como por la PKC (GCm, tetraKCNG, NHE, Cav [Catterall, 2016], CatSper, ACm2 y sAC) (Loza-Huerta, 2013).

En S. purpuratus se clonaron dos canales iónicos activados por hiperpolarización y nucleótidos cíclicos (HCN), SpHCN1 (Gauss y col., 1998) y SpHCN2 (Galindo et al. 2005), y ambos se detectaron en el flagelo del espermatozoide (Galindo y col., 2005; Gauss y col., 1998). El análisis de la secuencia de SpHCN2 muestra que tiene varios sitios posibles de fosforilación: dos por PKA (S54 y S82), cinco por PKC (T60, S104, S204, S385 y T409) y uno por tirosina cinasa, y que el dominio de unión de nucleótidos es de 135 aminoácidos, el cual tiene 44% de identidad con el de SpHCN1 (Galindo y col., 2005). Un canal similar al SpHCN1 que se activa directamente por AMPc y es tres veces más selectivo para K+ que para Na+, se estudió en eem hinchados mediante experimentos de Patch-clamp (Sánchez y col., 2001). Dada su selectividad, en condiciones fisiológicas, cuando el canal se abre el sodio entra despolarizando la célula, lo cual sugiere su participación en la respuesta del espermatozoide posterior a la hiperpolarización inicial disparada por el speract. Como los canales HCN están involucrados en la periodicidad en otros tipos celulares, se ha propuesto que en el eem podría modular el batido flagelar y participar en la quimiotaxis (Kaupp y Seifert, 2001).

En ausencia de síntesis de proteínas, como en el espermatozoide, la fosforilación se vuelve un mecanismo importante para regular la función de muchas proteínas. Por lo tanto, los resultados mencionados indican que las proteínas que participan en la movilidad estimulada con el speract modulan su función por cambios en su estado de fosforilación inducidos por la PKA y/o por la PKC.

Además, los resultados de experimentos de inmunoprecipitación e identificación por espectroscopia de masas mostraron que la SUsAC forma complejos con al menos 10 proteínas de la membrana plasmática y del axonema del eem (Nomura y Vacquier, 2006): el intercambiador Na+/H+ específico del espermatozoide, dos cadenas pesadas de dineínas (la 7 y la 9), el canal iónico SpHCN, la GCm, la FDE5, la CK, el receptor del speract y -tubulinas. Estos resultados llevaron al grupo a proponer que las proteínas asociadas a la SUsAC podrían ser importantes en unir la señalización de la membrana plasmática a la utilización de energía en la regulación de la movilidad del espermatozoide (Nomura y Vacquier, 2006). Además, en el caso del ratón, el sNHE tiene un sitio de unión putativo para nucleótidos cíclicos (Wang y col., 2003). Esto último, junto con el hecho de que la SUsAC y el sNHE se encuentren interactuando en esta célula, sugiere que el AMPc regula al sNHE. También es importante recordar que la eliminación independiente de los genes que codifican para la sAC (Esposito y col., 2004) o el sNHE causan infertilidad en los ratones, debido a defectos severos en la movilidad de los espermatozoides (Wang y col., 2003), lo cual pone de manifiesto la importancia de ambas proteínas en la fisiología del espermatozoide.

10. ¿La sAC, PKA y Epac están en la mitocondria del eem?

En células somáticas se han encontrado más de 60 fosfoproteínas mitocondriales (Pagliarini y Dixon, 2006), lo que sugiere que la fosforilación reversible de proteínas es un mecanismo importante en la actividad mitocondrial (Deng y col., 2011; Pagliarini y Dixon, 2006). Se ha reportado que el AMPc sintetizado dentro de la mitocondria regula la fosforilación oxidativa (Acin-Pérez y col., 2010; Valsecchi y col., 2014) y aunque inicialmente se dudaba de la presencia de la AC y de la PKA dentro de la mitocondria, hay evidencias de que la vía de señalización completa CO -HCO -sAC-AMPc-PKA está en el interior mitocondrial de células 2        3 somáticas (Acin-Pérez y col., 2010; Valsecchi y col., 2014).

El eem posee sólo una mitocondria (fig. 2), responsable de generar la mayor parte de la energía (en forma de ATP) que la célula necesita para nadar hacia el óvulo y fecundarlo (revisado en García-Rincón y col., 2016). Sabemos que la estimulación de los eem S. purpuratus con agentes que afectan la función mitocondrial por diferentes mecanismos aumentan el Ca2+ mitocondrial (Ardón et al. 2009) y que el speract, mediante el incremento de pHi, despolariza la mitocondria (disminuye su Emit) y eleva los niveles de NADH, independientemente de Ca2+ externo (García-Rincón y col., 2016). Además, como se mencionó antes, el ATP es esencial para que las dineínas (motores del flagelo) funcionen y el espermatozoide nade (revisado en Nishigaki y col., 2014). Todo lo anterior pone de manifiesto la importancia que tiene la única mitocondria (fig. 2) del eem en la movilidad del espermatozoide y en la fecundación.

Como ya se dijo, la SUsAC se distribuye a lo largo del espermatozoide y anticuerpos específicos contra la enzima marcan de manera particular el área de su mitocondria (Beltrán y col., 2007a; Vacquier y col., 2014). Debido a lo anterior, Juan Pablo González-Mora (2016), en su tesis de licenciatura, se preguntó si la SUsAC está en la mitocondria del eem; en ese trabajo se mostró –mediante anticuerpos específicos y experimentos de WB– que la SUsAC y la PKA se encuentran en las fracciones de mitocondrias aisladas en gradientes de densidad, a partir de eem S. purpuratus, y el análisis proteómico de dichas fracciones corroboró la presencia de ambas enzimas en los mencionados organelos. Además, experimentos de inmunofluorescencia nos permitieron mostrar que la PKA (fig. 3), al igual que la SUsAC (Beltrán y col., 2007a), se distribuye a lo largo del espermatozoide de S. purpuratus, marcando también las áreas del acrosoma y de la mitocondria. Los resultados preliminares de microscopía electrónica de transmisión corroboraron la presencia de la SUsAC en la mitocondria del eem. Lo anterior apoya el hecho de que tanto la SUsAC como la PKA se encuentran en la mitocondria del eem (González-Mora, 2016), como se mostró de forma funcional (para la sAC) y mediante microscopía electrónica (en el caso de PKA) en los espermatozoides de toro (Mizrahi y Breitbart, 2014), desde donde podrían modular la movilidad y la reacción acrosomal, funciones esenciales del espermatozoide.

Finalmente, según se indicó antes, otro de los blancos de AMPc son las Epac, proteínas multidominio cuya región catalítica C-terminal posee un factor de intercambio de nucleótidos de guanina (GEFs) específico para las GTPasas pequeñas Rap1 y Rap2. Epac cataliza la conversión de Rap1 y Rap2 de una forma inactiva (Rap-GDP) a una activa (Rap-GTP) (De Rooij y col., 1998; Kawasaki y col., 1998). Las Epac regulan un sinnúmero de procesos celulares en diferentes tejidos (revisado en Lewis y col., 2016), que incluyen adhesión, proliferación, diferenciación y supervivencia celular, además de regulación de intercambiadores como la isoforma 3 del Na+/H+ (NHE; Honegger y col., 2004), canales iónicos (Zhang y col., 2009) y señalización mediada por Ca2+ (Kang y col., 2006; Morel y col., 2005; Schmidt y col., 2013). Hay evidencia de la participación de Epac en diferentes eventos importantes para la fecundación en espermatozoides de mamíferos (Miro-Moran y col., 2012). En la cabeza de los de ratón se identificó la vía de señalización AMPc-Epac (Amano y col., 2007) y se demostró que Epac está involucrada en el batido flagelar de los espermatozoides de hámster (Kinukawa y col., 2006). Además, mediante el uso de un anticuerpo policlonal anti-Epac, generado en conejo contra el péptido sintético LREDNCHFLRVDK (Branham y col., 2006), cuya secuencia es idéntica en las dos isoformas de humano, correspondiente a los residuos 285-297 de Epac1 (De Rooij, y col., 1998) y 438-450 de Epac2 (Ueno y col., 2001). Ruete et al. (2014) demostraron que Epac participa en la reacción acrosomal de los espermatozoides de humano. El genoma de S. purpuratus contiene las secuencias predichas de dos isoformas de Epac2: SpEpac2 X1 (XP_011668470.1, peso molecular calculado [PMc]=103119 Da) y SpEpac2 X2 (XP_784278.3, PMc=102075 Da), las cuales tienen identidades de 56 y 57% y homologías de 73 y 74%, respectivamente,  con Epac2 de humano (Q8WZA2), también conocida como factor de intercambio 4 de nucleótidos de guanina de Rap. Dado que la secuencia del epítopo para generar el anticuerpo contra las Epac1/2 de humano (Branham y col., 2006; Ruete y col., 2014) está altamente conservada (12/13 aminoácidos) en las dos isoformas de SpEpac2 (X1 y X2), utilizamos dicho anticuerpo  y mediante experimentos de WB detectamos una banda de ~100 kDa tanto en membranas de flagelos (Beltrán, inédito) como en la fracción mitocondrial del eem S. purpuratus (González-Mora, 2016), la cual podría corresponder a cualquiera de las dos isoformas (X1 o X2) de SpEpac2. Además, encontramos que un inhibidor selectivo para Epac (Nebenfuhr, 2002), Brefeldina A (200 μM), disminuye (~5-8%) poco pero significativamente la velocidad de nado circular de los espermatozoides de la misma especie (Loza- Huerta, 2013). Aunque faltan experimentos por hacer, los resultados anteriores sugieren que Epac está en el flagelo y en la mitocondria del eem S. purpuratus, como se ha propuesto en otros sistemas (Valsecchi y col., 2014), y que dicho blanco de AMPc (Epac) también participa en la fisiología del eem.

11. Comentario final

Es claro que el AMPc es indispensable para las funciones esenciales del espermatozoide de erizo de mar (movilidad, quimiotaxis y reacción acrosomal) y que para cumplir con su tarea necesita tener fuentes de producción (ACs) distribuidas estratégicamente en toda la célula. Sin embargo, dado que su acción depende de una regulación de la localización espacio-temporal altamente precisa, es fundamental que tanto las ACs como las FDEs que hidrolizan el AMPc se desempeñen en el instante y lugar donde se necesitan. Para esto, es indispensable que las proteínas que regulan a cada una de las ACs (Canales iónicos de Ca2+, CaM, PKA, PKC, proteínas G heterotriméricas, NHE, fosfatasas, receptores acoplados a proteína G (GPCR) etcétera) (sAC y ACm) y a las FDE de AMPc operen en sintonía. Sabemos que tanto las ACs como las FDEs (Francis y col., 2011; Maurice y col., 2014) se relacionan con diferentes juegos de proteínas en distintos microdominios de membrana; sin embargo, también podrían asociarse, como en los mamíferos, en diferentes señalosomas (ver sección VIII.1). Para tener un mejor entendimiento de los mecanismos de acción del AMPc en la fisiología del espermatozoide, es determinante identificar a las proteínas con las cuales interactúan las diferentes ACs formando complejos, no sólo en la membrana sino en el interior de la célula. La proteómica subcelular además de mostrarnos qué proteínas están dentro de las células, nos ayuda a comprender en dónde residen. Falta un largo camino por recorrer y experimentos por hacer para desentrañar la diversidad y complejidad de la señalización del AMPc en el espermatozoide.

Glosario

AC: adenil ciclasa.
ACm: adenil ciclasa de membrana.
AKAP: proteína de andamiaje de cinasa A. AMPc: adenosina 3´,5´-monofosfato cíclico. ATP: adenosina trifosfato.
BL: balsa lipídica.
[Ca+2]i: concentración de calcio intracelular CaM: calmodulina.
DDA: 2’,5’-Dideoxiadenosina. EJ: gelatina del óvulo.
Em: potencial de membrana.
Epac: proteína intercambiadora de nucleótidos de guanina activada por AMPc.
FDE: fosfodiesterasa.
Gs: proteína G estimuladora. GC: guanil ciclasa.
GCm: GC de membrana.
GMPc: guanosina monofosfato cíclico. kDa: kilodaltones.
KH7: ácido propanoíco 2-(1Hbenzimidazol- 2-iltio)-2-[(5-bromo-2-hidroxifenil) metileno] hidracida.
MS/MS: espectrometría de masas en tándem.
mV: milivolts.
NHE: intercambiador Na+/H+.
sNHE: NHE específico del espermatozoide. PFS: polímero de fucosa sulfatada.
pH: potencial de hidrógeno intracelular. PKA: proteína cinasa dependiente de AMPc.
PKC: proteína cinasa C estimulada por diacilglicerol.
PM: peso molecular. RA: reacción acrosomal.
RSP: AKAP, llamada así por sus siglas en inglés para Radial spoke protein.
Sx: serina, donde x = número de aminoácido.
sAC: adenilil ciclasa soluble.
SAP: péptido activador de los espermatozoides.
Sp: Strongylocentrotus purpuratus.
SpHCN: canal iónico regulado por hiperpolarización y nucleótidos cíclicos de Sp.
SUsAC: sAC de erizo de mar.
Tx: treonina, donde x = número de aminoácido.
WB: Western Blot.