Procedimientos diagnósticos en las infecciones virales

Indice

• Procedimientos diagnósticos
• Aislamiento del virus
• Neutralización del virus
• Pruebas de protección
• Colección y envío de muestras
• Glosario

Procedimientos diagnósticos

Los procedimientos básicos para el diagnóstico de laboratorio de virus, son el aislamiento del virus, la demostración del virus o algún producto viral en las muestras clínicas (método directo), y la detección y medición de los anticuerpos específicos contra un virus (método indirecto). Cada procedimiento tiene sus méritos, pero la demostración directa del virus y/o de los productos virales es el método más eficaz y útil en el diagnóstico de rutina.

Procedimientos de demostración

Los métodos directos incluyen la visualización de los viriones al microscopio electrónico, detectando el genoma viral empleando sondas de referencia de AADN y detectando antígenos virales por inmunofluorescencia. Este último método ha sido el más útil en el diagnóstico por laboratorio.

Métodos de serología general

Durante los estados tardíos de la enfermedad, la prueba del suero de los animales infectados, en busca de anticuerpos para virus específicos puede ser el único medio de diagnóstico. Esto puede lograrse mediante varias pruebas serológicas.

Las pruebas serológicas más comúnmente empleadas en los laboratorios de diagnóstico veterinario para el diagnóstico de infecciones virales son: prueba de seroneutralización (SN); prueba de inhibición de la hemoaglutinación (IH); prueba de la inmunodifusión en gel de agar (AGID por sus siglas en ingles) y prueba de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA). Estas pruebas se basan en el hecho de que la actividad viral puede ser inhibida y/o las proteínas virales se ligan a un anticuerpo específico. Se prueban las diluciones del suero y se comunican los resultados como el reciproco de la dilución mas elevada en la cual se observa actividad antiviral. De manera ideal, se compararían los resultados del suero colectado durante la fase aguda de la enfermedad con los resultados del suero colectado durante la convalecencia (dos colecciones de suero 14 - 21 días aparte). El diagnóstico se confirma si se observa un incremento cuatro veces mayor de los títulos de anticuerpos entre estos dos pares de muestras.

Los resultados de una sola muestra de suero (no pareada) son más difíciles de interpretar. Para los virus que causan una infección aguda y se limitan así mismos, los resultados positivos solamente indican que el animal ha estado expuesto, ya sea naturalmente o a través de una vacunación. La interpretación se hace más fácil al muestrear un porcentaje de aquellos animales que estuvieron enfermos versus aquellos que no lo estuvieron, pues los títulos más altos generalmente indican una infección reciente. Para los virus que causan una infección persistente o latente (ejemplo los herpesvirus o retrovirus), una serología positiva indica que el animal es un portador potencial del virus.

Los resultados positivos de pruebas reguladoras son siempre significativos sin importar el título de anticuerpo. Por ésta razón, se han desarrollado otras pruebas serológicas más estandarizadas y en forma de estuche de muestreo (kit). Por ejemplo la prueba de inmunodifusión en gel de agar (AGID), conocida también como prueba de Coggins, para la anemia equina infecciosa y la prueba de ELISA y aglutinación de látex (LA) para seudorrabia. Los resultados de estas pruebas son comunicados como positivos o negativos. A continuación una discusión sobre los diferentes procesos de diagnóstico empleados.

Aislamiento del virus

Empleo: aislamiento e identificación del virus.

Durante la fase aguda de la enfermedad es el mejor momento para demostrar y aislar virus. A medida que la enfermedad avanza, se desarrollan los anticuerpos, se reduce la excreción de virus y el virus es despejado de los tejidos.

Las manifestaciones clínicas de la enfermedad generalmente encausan la selección de la muestra clínica apropiada, tales como hisopos nasales y oculares en las infecciones de las vías respiratorias altas, heces de infecciones entéricas, sangre de infecciones sistémicas, etc.

Los virus requieren de células vivas para poderse replicar. En el laboratorio, se proporcionan células vivas como cultivos celulares, cuyas células han sido obtenidas por digestión enzimática de tejidos animales. Las células son cultivadas en superficies de vidrio o plástico.

Cuando las muestras clínicas que contienen virus son inoculadas en cultivos celulares susceptibles, el virus (si está viable) se replica y a menudo produce un comportamiento característico de patología celular, caracterizado por cambios en la apariencia celular, llamado efecto citopático (CPE por sus siglas en ingles). En algunos casos, el virus se replica sin ningún efecto apreciable sobre las células y debe ser demostrado mediante pruebas de tinciones especiales que revelan cuerpos de inclusión viral o anticuerpos fluorescentes (AF), para detectar antígenos virales. El tiempo requerido para el aislamiento del virus fluctúa entre menos de 24 horas y hasta varias semanas.

Anticuerpo fluorescente

Empleo: Para detectar antígeno viral en materiales clínicos o en cultivos celulares infectados.

La prueba de anticuerpos fluorescentes (AF) detecta antígenos virales en células infectadas con anticuerpos antivirales específicos que han sido marcados con un colorante fluorescente (isotiocianato de fluoresceína). Las pruebas de AF se efectúan en secciones de tejidos congelados, frotis de sangre, impresiones tisulares, raspados o en cultivos celulares. Los resultados están disponibles en menos de una hora y son exactos a condición de que el anticuerpo sea específico y las muestras estén en condiciones moderadamente buenas. Hay dos tipos básicos de técnicas de AF: directa (DFA) e indirecta (IFA). En la prueba directa se marca el antígeno antiviral. Este antígeno marcado se emplea para detectar los antígenos virales en secciones congeladas de tejidos, raspados, frotis sanguíneos, etc.

La técnica IFA es un procedimiento en dos pasos: La muestra a ser examinada se hace reaccionar con un anticuerpo antiviral no marcado. Después de proporcionar un período de incubación suficiente para que haya una interacción antígeno-anticuerpo (generalmente una hora o menos), se lava la muestra y se incuba con un anticuerpo marcado dirigido contra IgG de la muestra en la cual se preparó el anticuerpo antiviral no marcado. Este anti-anticuerpo marcado se anclará al anticuerpo no marcado anclado al virus, y si esto ocurre, se observa la fluorescencia y la prueba se considera positiva.

Ambas pruebas FA tienen ventajas y desventajas. La técnica DFA se lleva a cabo más rápidamente y se emplea más a menudo debido a la disponibilidad de los conjugados DFA. La técnica IFA, por otra parte, generalmente es más sensible y específica (si se emplean anticuerpos monoclonales); se tarda más tiempo pero solo requiere un anticuerpo marcado si todos los anticuerpos antivirales son preparados en una sola especie.

La prueba de inmunofluorescencia o anticuerpo fluorescente (FA) es la prueba más útil empleada rutinariamente en el diagnóstico viral. Comercialmente está disponible un buen número de conjugados AF para la detección de virus. Los conjugados que detectan virus en perros y gatos están disponibles comercialmente.

Se emplea un método indirecto llamado prueba de inmunofluorescencia para detectar y medir anticuerpos. Esto involucra el infectar un cultivo de células con un virus y después preparar“puntos” en láminas de microscopio con estas células infectadas. El suero puede entonces ser examinado para un anticuerpo específico haciéndolo reaccionar con las células infectadas seguido de una reacción con el conjugado anti-especie IgG. Los "puntos" que fluorescen (resultantes de la unión anticuerpo sérico más conjugado anti-especie IgG) indica que el suero es positivo para la presencia de anticuerpos específicos.

Inmunoperoxidasa

Empleo: para detectar antígeno viral en materiales clínicos y cultivos celulares.

La técnica de inmunoperoxidasa es similar en principio al proceso de anticuerpo fluorescente. La diferencia está en que el anticuerpo es conjugado a una enzima (peroxidasa de rábano o fosfatasa alcalina), más que a un compuesto fluorescente. Aunque la enzima está ligada al anticuerpo, esta permanece activa y cuando se le suministra su substrato, reacciona y da una reacción en color. Esta técnica tiene la ventaja sobre la AF de que no requiere de microscopio fluorescente y es específicamente útil para localizar antígenos virales en lesiones histopatológicas.

Prueba de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA)

Empleo: Para detectar antígeno o anticuerpo.

La sensibilidad de ELISA es comparable con el radioinmunoensayo (RIA), el cual es similar en principio a la prueba de ELISA.

Se emplea un sistema de fase sólida para la mayoría de las pruebas ELISA. Para la detección de virus, primero se adsorbe un anticuerpo específico a la superficie de un tubo de poliestireno, placa de microtítulo, etc. y se añade la muestra que contiene el virus sospechoso. Si el virus está presente, este se une al anticuerpo adsorbido. Después de lavado, se adiciona un anticuerpo antiviral específico marcado con una enzima (generalmente fosfatasa alcalina o peroxidasa de rábano). El anticuerpo marcado reacciona con el complejo, creando un "efecto Sándwich". Luego del lavado, se adiciona el substrato para la enzima, produciéndose una reacción de coloración. Algunas pruebas se interpretan visualmente, pero se obtiene una mayor sensibilidad mediante el análisis espectrofotométrico.

Un proceso indirecto de ELISA es empleado para la detección de anticuerpos. El antígeno es primero adsorbido a una fase sólida, seguido por la adición del suero a analizar. Después del lavado, se adiciona una anti-gamaglobulina marcada con una enzima, seguida de la adición de substrato enzimático. Las variaciones de la prueba corriente de ELISA incluye la competitividad de ELISA para detectar el anticuerpo, en el cual la anti-gamaglobulina marcada con una enzima es reemplazada con un anticuerpo antiviral marcado con una enzima. El desarrollo de la coloración posterior después de la adición del substrato enzimático es inversamente proporcional al nivel de anticuerpo presente en la muestra analizada. En otras palabras, si el anticuerpo específico ha sido ligado, el anticuerpo marcado con una enzima no se ligará. Así, las pruebas positivas son aquellas que no presentan una reacción de color o una reacción menor que aquella de los controles apropiados. Otra variación es la cinética por ELISA, la cual se emplea para detectar anticuerpos contra la borreliosis canina (enfermedad de Lyme), virus de la leucemia felina, peritonitis infecciosa felina, toxoplasmosis felina y herpes virus bovino 1. En la cinética por ELISA, la reacción se monitorea continuamente durante cierto período de tiempo, en lugar de pararla después de un tiempo predeterminado.

La prueba de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) y los sistemas de aglutinación de látex (LA) detectan antígenos virales mediante la "captura" de los mismos con anticuerpos específicos adsorbidos a un substrato apropiado.

Estas técnicas proporcionan un diagnóstico rápido y están a menudo disponibles para su uso en "la oficina". Los estuches disponibles comercialmente incluyen los estuches de ELISA y LA para detectar rotavirus en heces de una gran variedad de especies animales, y estuches de ELISA rápidos para detectar parvovirus canino en las heces y antígeno de la leucemia viral felina en sangre.

Aglutinación de látex (LA)

Empleo: Para detectar antígeno o anticuerpo.

Las pruebas de LA son similares en principio a la aglutinación bacterial ya que las partículas de látex cubiertas con anticuerpo, se aglutinarán cuando se mezclen con el antígeno correspondiente y así lo identificarán.

A la inversa, las partículas de látex pueden ser cubiertas con antígenos y emplearlas para detectar anticuerpos. Estas pruebas son fáciles de efectuar y producen resultados en pocos minutos. Los estuches comerciales empleados "en la oficina" están disponibles para detectar anticuerpos de algunas enfermedades y para detectar algunos virus.

Microscopio electrónico (ME)

Empleo: Para demostrar virus en muestras clínicas.

En la técnica de microscopia electrónica con tinción negativa, las muestras clínicas lisadas con agua destilada, se "tiñen" con una solución de átomos pesados. Esta técnica se emplea principalmente para el examen de aquellas muestras clínicas en las que se espera contengan un gran número de partículas virales, tales como heces (coronavirus, rotavirus y parvovirus) y lesiones vesiculares y similares a la viruela (herpesvirus y virus de la viruela). La preparación de la muestra y el examen ME generalmente puede completarse en 30 minutos.

Microscopio inmunoelectrónico

Empleo: Demostración e identificación de virus.

La técnica de tinción negativa del microscopio electrónico mencionada anteriormente para la demostración de virus, es también útil para la identificación. El virus se hace reaccionar con el suero inmune, produciendo una agrupación que puede ser vista cuando se observa bajo el microscopio electrónico.

Neutralización del virus (NV)

Empleo: para detectar y medir anticuerpos.

La neutralización del virus es el método más ampliamente empleado para detectar y medir anticuerpos virales de importancia en veterinaria. Esta prueba es considerada como la más exacta de todos los procesos serológicos, siendo menos propensa a variaciones y menos subjetiva en su interpretación. El principio de ésta prueba se basa en el hecho de que la replicación y actividad del virus, ya sea el efecto citopático (EC) en el cultivo celular, signos clínicos, lesiones o muerte en huevos embrionados y en animales, que pueden ser inhibidos por un anticuerpo viral específico. Las pruebas De NV son casi siempre desarrolladas empleando cultivos celulares. La cepa de virus para utilizar en las pruebas se cultiva, se alícuota y se almacena a temperaturas ultra-bajas. Estos virus son dosificados varias veces para determinar la cantidad de virus presente.

Las diluciones del suero de prueba se hacen en placas microtituladoras, seguido de la adición de un volumen igual de una suspensión viral diluida para contener aproximadamente 100 a 300 dosis infectantes (una dosis infectante es el número mínimo de partículas virales necesarias para establecer una infección). Después de incubar el suero + virus durante 1 - 2 horas a temperatura ambiente (algunos sistemas utilizan 37°C o aún 4°C), se adicionan indicadores de cultivos celulares. Las placas se sellan, se incuban a 37°C, y se observan diariamente para ver el desarrollo del efecto citopático viral. La presencia de anticuerpo específico en el suero a analizar inhibe la producción de este efecto citopático.

La prueba de NV se emplea también para identificar un virus desconocido, aislado de la misma manera descrita anteriormente. La única diferencia es que el anticuerpo es conocido y el virus es desconocido. Si el anticuerpo específico inhibe el desarrollo de EC del virus desconocido, se realiza la identificación.

Prueba de inhibición de la hemoaglutinación

Empleo: Para detectar y medir anticuerpos.

La prueba de inhibición de la hemoaglutinación (IH) es similar en principio a la prueba NV, excepto que la actividad viral inhibida es la hemoaglutinación. Las pruebas IH son muy sensibles y altamente específicas, y particularmente útiles para medir anticuerpos contra aquellos virus hemoaglutinantes que se replican mal en cultivos celulares o producen poco o ningún efecto citopático. Los ejemplo s de tales virus son el virus de la influenza Tipo A en la mayoría de las especies, el virus de Newcastle de las aves y el parvovirus porcino. Las pruebas IH se efectúan en placas microtituladoras. Se hacen las diluciones del suero a analizar, seguido de la adición de un volumen igual de suspensión viral diluida que contenga aproximadamente 4 a 8 unidades HA (una unidad HA es la dilución más alta de la muestra viral que produce una hemoaglutinación completa). Se añade una suspensión apropiada de glóbulos rojos y las placas se mezclan suavemente y se dejan en incubación por 1 - 2 horas a 4°C (para la mayoría de los virus). Si esta presente el anticuerpo específico en el suero a analizar, se inhibirá la aglutinación de los glóbulos rojos y estos se posarán en un "botón" bien definido. Las células aglutinadas, en contraste, se posarán completamente en una capa delgada sobre todo el fondo del pozo de la placa o formarán un botón de borde desigual e irregular.

El suero a analizar contiene frecuentemente inhibidores no específicos de la aglutinación y debe primero ser adsorbido con glóbulos rojos antes de hacer la prueba.

Prueba de fijación de complemento

Empleo: Detección y medición de anticuerpos.

Las pruebas de fijación de complemento (FC) son más útiles como ayuda en el diagnóstico de una infección viral aguda o reciente, porque estas detectan primero IgM, la primera clase de inmunoglobulinas en responder a la infección.

La prueba impone el empleo de antígenos virales, complemento de cobayo y un sistema indicador de CRS de oveja sensibilizadas. Al reaccionar directamente al anticuerpo dirigido contra los antígenos virales, sensibiliza los CRS de oveja. Este anticuerpo anti-CRS de oveja se refiere como hemolisina y se prepara en conejos. El antígeno y el complemento son dosificados y diluidos. Si no hay presencia de anticuerpos específicos en el suero problema, el complemento queda libre para reaccionar con los CRS sensibilizados produciendo lisis. Si están presentes suficientes anticuerpos, el complejo antígeno-anticuerpo específico habrá fijado al complemento y no se presentará lisis de los CRS.

Inmunodifusión

Empleo: Para detectar anticuerpos y antígenos específicos.

Las dos técnicas más empleadas de inmunodifusión son el sistema de placa de doble-difusión y la imunoelectroforesis. Ambas pruebas se realizan en medio semisólido generalmente agar o agarosa. La diferencia esencial entre estos métodos es que en la imunoelectroforesis el antígeno es previamente fraccionado electroforéticamente antes de ser cubierto por el anticuerpo. En ambos métodos, el antígeno y el anticuerpo se funden uno contra otro formando una línea de precipitación en donde ellos reaccionan. El sistema de placa de doble-difusión es la prueba de diagnostico más comúnmente empleada. El ejemplo más conocido es la "Prueba de Coggins" para la anemia equina infecciosa.

La prueba de inmunodifusión se puede hacer más sensible empleando un marcador radioactivo, el cual permitirá la detección de reacciones antígeno-anticuerpo no visibles al ojo humano. El marcador radioactivo generalmente es el yodo (125I),tanto el antígeno el anticuerpo pueden ser marcados. El marcaje ocurre por el acoplamiento de 125I al aminoácido tirosina. Las pruebas se leen cubriendo las placas o laminillas con una película de rayos x (radiografía) que registran las líneas radioactivas (precipitación).

Pruebas de protección

Empleo: identificación de virus.

Las pruebas de protección se emplean para la identificación de virus cuando no se dispone de otros métodos menos engorrosos. Estas pruebas involucran la producción de una inmunidad activa o pasiva en un animal o animales seguidos por desafíos por el agente en cuestión.

Un ejemplo de la prueba de protección empleada anteriormente, es para la identificación del virus del cólera porcino. La prueba se llevo a cabo mediante la inyección de suero de anti-cólera porcino simultáneamente con sangre o suspensión de bazo de animales sospechosos de tener cólera porcino. Si el agente era el virus del cólera porcino, la inmunidad pasiva aportada por el suero anti-cólera porcino podría proteger al cerdo de la dosis de desafío. El control, un cerdo no protegido, padecería el cólera porcino.

Hibridación del ácido nucleico

Empleo: Para detectar secuencias de AADN o ARN viral en el ácido nucleico extraído de muestras clínicas.

La hibridación del ácido nucleico consiste en lo siguiente:

• La doble cadena del ácido nucleico de un virus es desnaturalizado con un álcali par separar las cadenas.
• Las cadenas sencillas del ácido nucleico se unen a un soporte sólido, generalmente nylon o membrana de nitrocelulosa, para prevenir que las cadenas se vuelvan a unir. El ácido nucleico se une a la membrana por medio de su columna vertebral de azúcar-fosfato; de esta forma las bases de nitrógeno están proyectadas hacia el exterior.
• Una sondas de referencia (molécula de ADN o ARN de cadena sencilla de origen conocido – conteniendo la secuencia de nucleótidos específica del virus blanco – marcada con una enzima o átomo radioactivo) es añadida a la membrana.
• Ocurre la formación de uniones de hidrógeno entre las bases complementarias. Las sondas de referencia que no reaccionaron son removidas mediante lavado y se detecta la hibridación mediante un ensayo para detectar a la sondas de referencia.

Se emplean diferentes formas de ensayos de hibridación de fase sólida:

Hibridación de Southern. Es una técnica empleada para identificar la presencia de un fragmento específico de ADN.

Hibridación de Northern. Se emplea para detectar secuencias específicas de RNA.

Hibridación de mancha (Dot Blot). Es un proceso similar al Southern y al Northern y puede emplearse para detectar tanto AADN como ARN. La diferencia es que el ácido nucleico es colocado dentro de la nitrocelulosa en un aparato que se enfoca sobre los puntos individuales en áreas de concentración, parecido a las placas microtituladoras.

Hibridación in situ. El principio de estas técnicas es similar a la hibridación de Southern y de Northern (detección de secuencias especificas de nucleótidos mediante una sondas de referencia marcada) excepto en que más que la extracción del ácido nucleico y su transferencia a una membrana de nitrocelulosa, se prueban las células intactas o secciones de tejido al microscopio. Esta técnica se emplea poco en el diagnostico rutinario, sin embargo es muy valiosa en estudios de investigación y patogénesis.

Las técnicas de análisis de restricción enzimática, reacción en cadena de la polimerasa y análisis de datos obtenidos de microarreglos de ADN, son particularmente útiles y se discutirán enseguida.

Análisis de restricción de enzimas

Empleo: identificación de virus específicos.

El análisis de restricción de enzimas utiliza las enzimas llamadas endonucleasas de restricción para "perfilar" la secuencia del genoma de los virus. La presencia de mutaciones y/o variaciones genéticas en los sitios potenciales de clivaje en algunas cepas virales, producen diferentes modelos de fragmentos cuando son separados en un gel de agarosa. Este análisis es llamado polimorfismo en la longitud de los fragmentos de restricción (RFLP) y se ha empleado para caracterizar y comparar entre muestras aisladas en el campo de un virus dado.

La técnica requiere gran cantidad de ADN viral purificado o parcialmente purificado, un juego de enzimas restrictivas para clivar el ADN, la capacidad para separar los fragmentos de ADN resultantes por electroforesis y un método para documentar los resultados.

El clivaje por restricción del genoma de virus con genomas grandes, tales como los citomegalovirus, puede producir 20 a 50 bandas ADN, mientras que los virus con genomas más pequeños como los adenovirus, generalmente producen solo cinco a diez bandas ADN. No hay una forma fácil, ni es por lo general necesario, para correlacionar el modelo (bandas faltantes o extras) con mutaciones de localizaciones específicas en el genoma sin un estudio amplio de hibridación molecular o aún de secuencias del genoma que se está comparando. Una limitación distinta del método es que la presencia de una mutación no puede ser detectada a menos que esa mutación se encuentre dentro de la secuencia de reconocimiento de la endonucleasa de restricción que se esta empleando la digestión del ADN. El empleo de diferentes enzimas de restricción optimizar la probabilidad de detección mutaciones en un genoma en particular o en una porción de genoma.

Reacción de cadena de la polimerasa

Empleo: identificación/ detección de virus específicos o secuencias especificas de un gen.

La reacción de cadena de la polimerasa (PCR) un método in vitro de replicación de ADN, es capaz de amplificar segmentos de ADN por más de un millón de veces. Una sola copia del genoma viral se amplía - si está presente en el material clínico- produciendo millones de copias que pueden ser fácilmente detectadas por electroforesis. Esto es logrado al crear una reacción mixta que, además de la muestra de ADN (conteniendo potencialmente el genoma blanco), contiene dos sondas de referencia de oligonucleótidos que complementan los extremos opuestos de cada cadena de la secuencia blanco, deoxinucleosidos trifosfatos y una polimerasa termoestable de ADN (polimerasa Taq).

La mezcla de reacción está entonces sujeta a un ciclo de temperatura con el fin de facilitar la replicación ADN y así aumentar la cantidad de ADN. Lo siguiente representa un ciclo típico:

• El primer paso del ciclo PCR es la desnaturalización de la muestra ADN mediante calentamiento de la mezcla de reacción a 95°C.
• Segundo, la mezcla es enfriada para permitir que los fragmentos se unan al ADN blanco.
• Tercero, la mezcla es calentada a 72°C para permitir la polimerización del ADN por la polimerasa Taq ADN. Se repite el ciclo de temperatura del PCR, típicamente 35 a 40 ciclos. De esta manera se pueden obtener más de un millón de copias del ADN.

Una vez completado el número de ciclos deseados, se separa el ADN blanco por electroforesis en gel y se analiza midiendo las bandas ADN o mediante la hibridación de Southern con sondas de referencia específicas.

En la actualidad se dispone comercialmente de cierto número de pruebas diagnosticas basadas en PCR. La PCR es aplicable al estudio de virus ARN si se emplea primero la transcriptasa reversa para hacer un cADN a partir del ARN blanco; denominado PCR transcriptasa reversa. Otras alternativas de PCR son la PCR "en tiempo real", la cual analiza simultáneamente las muestras espectrofotometricamente para visualizar la polimerización y la PCR anidada, la cual emplea un segundo equipo de sondas de referencia dentro de la región amplificada por el primer grupo. Cualquier técnica es útil cuando los niveles de ácido nucleico viral son bajos. La eficacia del PCR "en tiempo real" en diagnostico clínico todavía tiene que ser establecido.

Radioinmunoanálisis

Empleo: Para detectar antígeno o anticuerpo.

En la actualidad, los sistemas de radioinmunoanálisis se utilizan rara vez en los laboratorios de diagnostico veterinario.

Hay dos sistemas básicos de radioinmunoanálisi (RIA), fase líquida y fase sólida. En el sistema de fase líquida, los complejos antígeno-anticuerpo son precipitados por la subsiguiente adición de anti-gammaglobulina. El precipitado se recolecta por centrifugación y secado. La cantidad de radioactividad en el precipitado comparado con el total de radioactividad es una medida cuantitativa de la reacción antígeno-anticuerpo. El marcaje se hace con 125 I (ver inmunodifusión) y cualquiera de los tres componentes puede ser marcado.

En el sistema de fase sólida, se cubre el interior de un tubo de poliestireno con el anticuerpo y entonces reacciona con el antígeno. Brevemente, la muestra se adiciona al tubo de poliestireno previamente cubierto con un anticuerpo antiviral. Si el antígeno está presente, este se fijara al anticuerpo que cubre el tubo. Después del lavado, se adiciona el anticuerpo antiviral marcado con 125 I, el cual reacciona con el complejo produciendo un "efecto Sándwich". Se lava el tubo y se determina la cantidad de radioactividad.

Mientras que las técnicas mencionadas para la detección de antígeno se emplean como la primera aproximación para el diagnostico viral, en muchos casos estas técnicas no son aplicables porque frecuentemente las muestras apropiadas de animales vivos no están disponibles. Además, los sistemas de detección rápida del antígeno no están disponibles para muchas enfermedades virales. En estos casos, se intenta el aislamiento del virus.

Análisis de datos obtenidos de microarreglos de ADN

Empleo: identificación de virus específicos o secuencias virales específicas.

El desarrollo de los microarreglos ha sido propulsado por la aplicación de la tecnología robótica de rutina en la biología molecular, más que por cualquier descubrimiento fundamental. Las técnicas de hibridación de Southern y de Northern para la detección de ADN específico y especies de mARN aporta la tecnología básica para la hibridación de microarreglos.

La construcción de microarreglos implica el ver secuencias específicas de ADN sobre una lámina de vidrio o contenedor de sílice con la ayuda de tecnología robótica. La lámina de vidrio puede contener más de 50 000 genes. Las láminas son expuestas a una fuente de ADN marcado fluorescentemente. Un computador monitorea la fluorescencia sobre la lámina, indicando en done el ADN marcado se ha unido a la secuencia de ADN sobre la lámina.

Puesto que muchas de las secuencias ADN pueden presentarse sobre una lámina, es posible para el análisis de microarreglos el muestrear múltiples patógenos simultáneamente. Esto es particularmente importante para la determinación de armas biológicas y en el diagnostico de enfermedades. Se dispone comercialmente de varias microarreglos, tales como el sistema de detección CapitalBio_ SARSarrayTM-1.8 para identificar estados iniciales de infección con el virus de SARS (vea el capítulo 24).

Además de los microarreglos de ácidos nucleicos, también se esta llevando a cabo el análisis de microarreglo de proteínas. En este caso, uno está buscando la presencia de una proteína en particular.

Colección y remisión de especímenes

El diagnostico de laboratorio de enfermedades clínicas depende en gran parte de la clase y condiciones de las muestras remitidas. También depende de que el veterinario y laboratorio trabajen en estrecha colaboración. Puesto que muchas de las pruebas de laboratorio son para agentes específicos de enfermedad, todas las remisiones deben ir acompañadas de una historia clínica adecuada. Esto permitirá al personal del laboratorio el hacer pruebas adicionales si es necesario.

Las guías generales para la colección y remisión de muestras se presentan abajo. La mayoría de los laboratorios proporcionan un formulario de remisión de las muestras que puede ser completado con la información pertinente disponible. En ausencia de un formulario, el veterinario podrá proporcionar una historia clínica tan completa como sea posible. Los veterinarios deben contactar al laboratorio de diagnostico si tienen cualquier pregunta.

Animales

Se prefieren animales vivos o enfermos a animales muertos. Siempre que sea posible, los animales deben ser remitidos directamente al laboratorio de diagnostico para una necropsia completa. Si hay problema de hato, se debe remitir más de un animal. Se puede emplear el servicio de correo para embarcar animales pequeños, siempre y cuando sean empacados en contenedores herméticos aislados con suficiente hielo o "paquetes fríos". No congelar animales que serán remitidos para necropsia.

Tejidos

Para minimizar la contaminación durante la necropsia, es mejor recolectar rutinariamente un grupo de tejidos, antes del examen completo. Los tejidos recomendados son pulmón, riñón, hígado, bazo, intestino delgado, intestino grueso y nódulos linfáticos mesentéricos. Tejido cerebral o la cabeza deben también ser colectados si se sospecha de enfermedad del sistema nervioso central. Deben recolectarse otros tejidos que presenten anormalidades notadas durante el examen completo. Una porción de estos tejidos debe colocarse en bolsas plásticas herméticas y colocarlas en refrigeración. Mientras que se recomienda que cada tejido sea colocado en una bolsa separada, es absolutamente esencial que el intestino esté separado de otros tejidos, de otra manera el examen bacteriológico estará comprometido.

Los tejidos deben ser llevados directamente al laboratorio o enviados en refrigeración por correo certificado servicio de noche, autobús, o por servicio de mensajería. Los tejidos recolectados durante la segunda parte de la semana deben congelarse y enviarse el lunes.

Puesto que muchos virus producen lesiones microscópicas características, pequeños trozos de cada tejido (1/4 de pulgada de grueso) deben colocarse en formalina buferada al diez por ciento para examen histopatológico. Debe remitirse una mitad longitudinal completa del cerebro. Estas muestras no deben congelarse.

Heces

Las heces pueden ser recolectadas de animales con enfermedad aguda y colocadas en recipientes herméticos. Mientras los hisopos bien saturados son adecuados para muchos de los exámenes virológicos individuales, algunos mililitros o gramos de heces permiten un trabajo de diagnostico más completo, incluyendo el examen bacteriológico y parasitario. Las muestras deben ser remitidas al laboratorio empleando "paquetes fríos" como refrigerantes.

Hisopos

Se emplean hisopos nasales u oculares para el aislamiento de virus de animales con infecciones del tracto respiratorio superior. Las infecciones genitales también pueden diagnosticarse por el examen de hisopos recolectados del tracto reproductivo (vagina, pene, mucosa etc.). Estos hisopos deben recolectarse de animales con enfermedad aguda y deben ser colocados directamente en tubos con tapa de rosca que contienen un medio de transporte viral. El muestreo de varios animales en diferentes estados de la enfermedad incrementa la posibilidad de aislar el agente causal. Los hisopos también son útiles para el muestreo de lesiones vesiculares. Las vesículas frescas deben romperse y saturar el hisopo con el líquido exudado. Se deben recolectar dos hisopos, uno para el aislamiento de virus y uno para microscopía electrónica. Los hisopos para el aislamiento de virus deben ser colocados en medios de transporte viral y los hisopos para microscopía electrónica deben colocarse en un tubo con tapa de rosca que contenga una o dos gotas de agua destilada. También se debe remitir el material de costras de lesiones más avanzadas.

Laminillas

Un número de enfermedades infecciosas puede diagnosticarse mediante el examen de laminillas preparadas con sangre y tejidos. Los frotis de sangre se emplean para el diagnostico de leucemia felina, mientras que los frotis de sangre y raspados conjuntivales se emplean en el diagnostico de distemper canino. Los raspados conjuntivales en particular son útiles para el diagnostico de infecciones por herpesvirus y clamidia en gatos. Impresiones hechas del hígado, bazo y pulmones son especialmente útiles para el diagnostico de infecciones por clamidias y herpes virus en psitacinos.

Las laminillas deben tener suficiente cantidad de células para permitir un examen completo y no ser demasiado gruesas lo cual podría causar dificultades a la tinción. El raspador conjuntival o algún otro implemento (extremo romo de una hoja de bisturí) debe emplearse para raspar la conjuntiva; los hisopos de algodón no son adecuados. Los ojos con secreción deben limpiarse y enjuagarse antes de raspar la conjuntiva. Las impresiones de tejido deben hacerse mediante ligeros toques sobre la laminilla de microscopio con cortes frescos de tejido previamente secados con una toalla de papel para absorber algo de sangre. Las laminillas deben secarse al aire y ser enviadas al laboratorio en cajas para laminillas para prevenir que se rompan. Algunas laminillas permiten un trabajo de diagnostico más completo, incluyendo los exámenes citológicos.

Suero

Las muestras de sangre deben ser recolectadas en tubos estériles sin anticoagulantes. Estos deben remitirse al laboratorio en recipientes de poliestireno especialmente diseñados para evitar que se rompan. Las muestras de sangre no deben congelarse o permitir su sobre-calentamiento. Si las muestras no pueden ser enviadas al laboratorio dentro de un tiempo razonable, puede removerse el suero y refrigerarlo o congelarlo.

Glosario

Alícuota:
Dividir en partes iguales (como una solución)

Sondas de referencias:
Estos son pequeñas extensiones de ADN o ARN empleadas para iniciar la síntesis de ácido nucleico. Una sonda de referencia se hibridiza con una cadena modelo de ácido nucleico y suministra la terminación 3’ hidroxílica para la iniciación de la síntesis. Estas sondas de referencia s delimitan la región que será amplificada. En PCR, dos (a veces más) sondas de referencia s sintéticos de oligonucleótidos (con cerca de 20 nucleótidos cada uno) que son complementarios a las regiones en cadenas opuestas flanqueando la secuencia blanco; la terminación 3’ hidroxílica es orientada una a otra. En PCR la secuencia blanco de una muestra tiene entre 100 y 2000 bp de longitud. Se emplean sondas de referencia diseñadas y los sondas de referencia arbitrarias ("directamente de la repisa").

Pruebas regulatorias:
Estas son pruebas se llevan a cabo bajo el auspicio de agencias oficiales de control de enfermedades, con el fin de controlar importantes enfermedades animales infecciosas.

Endonucleasas de restricción:
Son enzimas derivadas de bacterias que reconocen y clivan secuencias específicas ADN.

Polimorfismo en la longitud de los fragmentos de restricción:
Estos revelan muchas diferencias en las secuencias ADN entre individuos de una especie. RFLPs son producto del clivaje de ADN por enzimas de restricción (ver arriba), separación de los fragmentos por electroforesis en gel y visualización de las bandas (fragmentos de ADN) por tinción con bromuro de etidio fluorescente.

Polimerasa Taq:
Esta es la polimerasa de ADN empleada en PCR. Es derivada de la bacteria Thermus aquaticus que vive en riachuelos de agua caliente; la termo-estabilidad de la polimerasa hace posible el PCR.