Diagnóstico laboratorial de infecções víricas

Índice

• Métodos diagnósticos
• Isolamento viral
• Neutralização viral
• Testes de proteção
• Coleta e remessa de amostras
• Glossário

Métodos diagnósticos

Os métodos básicos de diagnóstico virológico são o isolamento viral, detecção de vírus ou de produtos virais em amostras clínicas (métodos diretos); e detecção e quantificação de anticorpos anti-virais específicos (métodos indiretos). Cada método possui seus méritos, mas a demonstração direta do vírus e/ou de produtos virais é o método mais efetivo e útil para diagnóstico de rotino.

Métodos de demonstração (diretos)

Os métodos diretos incluem a visualização dos vírions por microscopia eletrônica, detecção do genoma viral através de sondas de DNA e detecção de antígenos virais por imunofluorescência. Esse último método tem sido o mais util em laboratórios de diagnóstico.

Métodos sorológicos gerais

Nos estágios tardios da infecção, a pesquisa de anticorpos específicos no soro pode ser o único método possível de diagnóstico. Isso pode ser feito por várias técnicas sorológicas.

As técnicas mais utilizadas em laboratórios de diagnóstico são a soro-neutralização (SN), inibição da hemaglutinação (HI), imunodifusão em gel de ágar (IDGA) e testes imunoenzimáticos (ELISAs). Esses métodos baseiam-se no fato de que a atividade viral pode ser inibida e/ou proteínas virais são ligadas por anticorpos específicos. Diluições do soro são testadas e os resultados são expressos como a recíproca da maior diluição do soro na qual a atividade antiviral pode ser detectada. De maneira ideal, resultados do teste de amostras coletadas na fase convalescente devem ser comparados com resultados de amostras coletadas na fase aguda da infecção (duas coletas, 14 a 21 dias de intervalo). O diagnóstico é positivo se ocorrer um aumento igual ou superior a quatro vezes nos títulos de anticorpos entre as amostras pareadas.

Os resultados de uma única coleta (não-pareada) e teste são mais difíceis de ser interpretados. Para os vírus que produzem infecções agudas auto-limitantes, testes positivos indicam apenas uma exposição prévia ao agente, devido à infecção natural ou vacinação. A interpretação pode ser facilitada pelo teste de um grupo de animais que estiveram doentes comparando-se com um grupo que não apresentou a doença, pois títulos mais altos geralmente são indicativos de refletem infecção recente. Para os vírus que produzem infecções persistentes ou latentes (exemplos: herpesvírus e retrovírus), sorologia positiva indica que o animal é um portador potencial do agente.

Resultados positivos de testes obrigatórios oficiais são sempre significativos independentemente do título de anticorpos. Por essa razão, outros testes de padronização mais fácil, na forma de kits, foram desenvolvidos. Exemplos são o teste de imunodifusão em gel de ágar (IDGA), também conhecido como teste de Coggins, para anemia infecciosa eqüina e ELISA e aglutinação em látex (LA) para doença de Aujeszky. Os resultados desses testes são considerados simplesmente positivos ou negativos. Uma discussão sobre as diferentes técnicas diagnósticas é apresentada a seguir nesse capítulo.

Isolamento viral

Uso: isolamento e identificação de vírus.

A fase aguda da doença é a melhor fase para se demonstrar e se isolar o vírus. Com a progressão da doença ocorre a produção de anticorpos, o que reduz a excreção viral e reduz ou elimina o vírus dos tecidos.

As manifestações clínicas da doença geralmente direcionam a escolha do material clínico apropriado para o diagnóstico, como secreções nasais e oculares no caso de infecções do trato respiratório superior; fezes em infecções entéricas, sangue em infecções sistêmicas, etc.

Os vírus requerem células vivas para replicar. No laboratório, células vivas são utilizadas em forma de cultivos celulares, cujas células são obtidas por digestão enzimática de tecidos animais. As células são cultivadas em superfície/frascos de vidro ou plástico.

Quando amostras clínicas contendo vírus são inoculadas em células susceptíveis, o vírus (se viável) replica e produz patologias celulares que se caracterizam por alterações morfológicas nas células, denominadas genericamente de efeito citopático (ecp). Em alguns casos, o vírus replica sem induzir patologia celular e a demonstração de sua presença requer o uso de técnicas de detecção de antígenos ou corpúsculos de inclusão por imunofluorescência (IF). O tempo necessário para se isolar um vírus varia entre menos de 24 horas até várias semanas.

Imunofluorescência (IF)

Uso: detecção de antígenos virais em amostras clínicas ou em células de cultivo infectadas.

O teste de imunofluorescência (IF) detecta antígenos virais em células infectadas utilizando anticorpos anti-virais específicos marcados com uma substância fluorescente (isotiocianato de fluoresceína, FITC). Testes de IF podem ser realizados em cortes congelados de tecidos, esfregaços sanguíneos, impressões de tecido ou em células de cultivo. Os resultados podem ser obtidos em menos de 1 hora – e são confiáveis desde que o anticorpo utilizado seja específico e as amostras estejam em boas condições.

Existem dois tipos principais de imunofluorescência: direta (IFD) e indireta (IFI). No método direto, o anticorpo anti-vírus é marcado. O anticorpo marcado é é usado para detectar antígenos virais em cortes de congelamento, esfregaços sanguíneos, raspados, etc...

A técnica indireta (IFI) é realizada em duas etapas. A amostra a ser testada é inicialmente incubada com um anticorpo anti-viral não-marcado. Após um determinado período de incubação para que ocorra a ligação anticorpo-antígeno (geralmente 1 hora ou menos), a preparação é lavada e então incubada com um anticorpo anti-espécie do anticorpo primário, marcado com FITC. O anticorpo anti-espécie irá se ligar no anticorpo anti-viral não-marcado, e se isso ocorre, emitirá luz fluorescente considerando-se o resultado como positivo.

Ambas as técnicas (IFD e IFI) possuem vantagens e desvantagens. A IFD é mais rápida e mais utilizada principalmente pela disponibilidade de conjugados. A técnica indireta (IFI), por outro lado, é mais sensível e mais específica (se anticorpos monoclonais são utilizados); é mais demorada mas requer apenas um tipo de anticorpo marcado com FITC se todos os anticorpos anti-virais foram preparados na mesma espécie.

A IF é a técnica mais utilizada no diagnóstico virológico de rotina. Um grande número de conjugados está disponível comercialmente para a detecção de uma grande variedade de vírus. Conjugados para a detecção de vírus de caninos e felinos são disponíveis no comércio.

Uma variação da técnica pode ser utilizada para a detecção e quantificação de anticorpos. Essa técnica envolve a infecção de cultivos celulares com um vírus e a preparação de lâminas de microscopia multipost com essas células infectadas. O soro pode ser testado para a presença de anticorpos específicos incubando-se com as células infectados, seguido da adição de um anticorpo contra IgG da espécie do soro-teste, conjugado com FITC. A emissão de fluorescência pelos spots de cultivos indica que a amostra é positiva para anticorpos anti-virais específicos.

Imunoperoxidase

Uso: detecção de antígenos virais em amostras clínicas ou em células de cultivo.

O princípio da técnica de imunoperoxidase é muito semelhante ao da imunofluorescência. A diferença é que o anticorpo é conjugado com uma enzima (peroxidase ou fosfatase alcalina) ao invés de fluoresceína. Embora a enzima esteja conjugada ao anticorpo, ela permanece ativa e, quando entra em contato com um substrato, age sobre este, resultando em mudança de cor. Essa técnica possui a vantagem sobre a IF de não necessitar microscópio de fluorescência e é especialmente útil para a detecção de antígenos virais em lesões histopatológicas.

Ensaios imunoenzimáticos (ELISAs)

Uso: detecção de antígenos ou anticorpos.

A sensibilidade dos testes de ELISA é equivalente à do radioimunoensaio (RIA), que e similar em princípio. Uma sistema de fase sólida é utilizado na maioria dos testes de ELISA. Para a detecção de vírus, os anticorpos específicos são inicialmente imobilizados na superfície de tubos ou placas de poliestireno e a amostra-teste contendo o vírus suspeito é então adicionada. Se o vírus está presente, irá se ligar nos anticorpos adsorvidos. Após lavagem, anticorpos anti-virais específicos conjugados com uma enzima (peroxidase ou fosfatase alcalina) são adicionados. Os anticorpos conjugados reagem com o complexo anticorpo-antígeno originando um efeito "sanduíche". Após nova lavagem, o substrato da enzima é adicionado, resultando na produção de coloração. Alguns testes podem ser visualizados e interpretados visualmente, mas a análise por espectrofotômetro aumenta a sensibilidade.

Um teste ELISA indireto é utilizado para a detecção de anticorpos. O antígeno é inicialmente imobilizado no suporte sólido, seguido da adição do soro-teste. Após lavagem, um anticorpo anti-imunoglobulina conjugado com a enzima é adicionado, seguido de adição do substrato da enzima.

Variações do teste ELISA incluem o ELISA competitivo para a detecção de anticorpos, no qual o anticorpo anti-imunoglobulina conjugado com a enzima é substituído por um anticorpo anti-viral conjugado com a enzima. A intensidade da coloração desenvolvida pelo substrato é inversamente proporcional ao nível de anticorpos presentes na amostra-teste. Em outras palavras, se o anticorpo específico se ligou, o anticorpo conjugado com a enzima não irá se ligar. Portanto, resultados positivos são aqueles em que não ocorre desenvolvimento de coloração no substrato ou a coloração é menos intensa do que nos controles negativos.

Outra variação é o ELISA de cinética, utilizado para a detecção de anticorpos contra o agente da doença de Lyme em cñes, vírus da leucemia felina, peritonite infecciosa felina, toxoplasmose felina e herpesvírus bovino tipo 1 (BHV-1). No ELISA de cinética, a reação é monitorada continuamente durante um certo período, ao invés de ser interrompida após um certo tempo de incubação. Testes imunoenzimáticos do tipo ELISA e aglutinação em látex (LA) detectam antígenos virais capturando-os através de anticorpos específicos adsorvidos em suportes apropriados.

Essas técnicas permitem um diagnóstico rápido e são freqüentemente disponíveis para uso em consultórios e clínicas. Kits comerciais incluem ELISAs e kits LA para a detecção de rotavírus em fezes de várias espécies animais, e kits de ELISAs rápidos para a detecção de parvovírus canino em fezes e antígenos do vírus da leucemia felina no sangue.

Aglutinação em látex (LA)

Uso: detecção de antígenos ou anticorpos.

Os testes de LA possuem um princípio semelhante à aglutinação bacteriana na qual partículas de látex recobertas com anticorpos aglutinam-se quando misturadas com o antígeno correspondente, identificando-o.

Alternativamente, as partículas de látex podem ser recobertas com antígenos para a detecção de anticorpos. Esses testes são de fácil execução e permitem a obtenção dos resultados em minutos. Kits comerciais para uso em clínicas são disponíveis para a detecção de anticorpos para algumas doenças e também para a detecção de alguns vírus.

Microscopia eletrônica (ME)

Uso: demonstração de vírus em amostras clínicas.

Na técnica de ME sob coloração negativa, preparações solubilizadas em água destilada de amostras clínicas são "coradas" com uma solução de átomos pesados. Essa técnica é primariamente utilizada para o exame de amostras clínicas suspeitas de conter um grande número de partículas virais, como fezes (coronavírus, rotavírus e parvovírus), lesões vesiculares e de lesões de "pox" (herpesvírus e poxvírus). A preparação e o exame da amostra por ME podem ser completados em menos de 30 minutos.

Imunoeletromicroscopia

Uso: detectar e identificar vírus.

A técnica de ME mencionada acima para demonstração de vírus pode também ser utilizada para se identificar vírus. O vírus é incubado com soro hiperimune específico, resultando em aglutinação das partículas que pode ser visualizada ao microscópico eletrônico.

Soro-neutralização (SN)

Uso: detectar e quantificar anticorpos.

A SN é técnica mais utilizada para a detecção e quantificação de anticorpos contra vírus de interesse veterinário. O teste é considerado o mais confiável de todos os testes sorológicos, sendo menos sujeito à variação e de interpretação mais objetiva.

O teste baseia-se na capacidade de anticorpos específicos neutralizarem o vírus correspondente e assim prevenir a sua replicação e a conseqüente produção de citopatologia em cultivo celular; ou sinais clínicos, lesões e mortalidade em ovos embrionados ou animais.

Os testes de SN são quase exclusivamente realizados utilizando cultivos celulares. O vírus em questão é previamente cultivado, quantificado e estocado em alíquotas à ultra-baixa temperatura. Esse vírus deve ser quantificado (titulado) várias vezes para que se determine exatamente a quantidade de vírus presente. Diluições do soro-teste são colocadas em placas de microtitulação, seguido da adição de uma quantidade fixa da suspensão viral aproximadamente 100 a 300 doses infecciosas por cavidade. Após a incubação do vírus com as diferentes diluições do soro-teste, geralmente 1 - 2 horas a temperatura ambiente (alguns sistemas utilizam 37°C ou 4°C), as células indicadoras são adicionadas. As placas são então incubadas a 37°C e observadas diariamente para o aparecimento de efeito citopático (ecp). A presença de anticorpos específicos no soro-teste impede a produção de ecp pelo vírus. Os testes de SN são também utilizados para se identificar isolados de vírus desconhecidos, essencialmente da mesma forma descrita acima. A única diferença é a que a especificidade dos anticorpos é conhecida e o vírus é desconhecido. Se um determinado anticorpo inibe a produção de ecp pelo agente desconhecido, então a identificação do vírus está feita.

Inibição da hemaglutinação (HI)

Uso: detecção e quantificação de anticorpos.

O princípio do teste de inibição da hemaglutinação (HI) é semelhante ao da SN, com a diferença que a atividade viral inibida pelo soro-teste é a capacidade hemaglutinante. Os testes de HI são muito sensíveis e altamente específicos, e são particularmente úteis para quantificar anticorpos contra vírus hemaglutinantes que não replicam bem em cultivo celular ou produzem ecp discreto ou dificilmente reconhecível. Exemplos são os vírus da Influenza tipo A de várias espécies animais, vírus da Doença de Newcastle e parvovírus suíno.

Os testes de HI são realizados em placas de microtitulação. Diluições do soro-teste são realizadas, seguidas da adição de um volume igual de uma suspensão contendo aproximadamente 4 a 8 unidades hemaglutinantes do vírus (uma unidade hemaglutinante é a maior diluição da suspensão viral capaz de produzir hemaglutinação completa). A suspensão apropriada de eritrócitos é então adicionada e as placas são incubadas durante 1 a 2 h a 4°C (para a maioria dos vírus). Se o anticorpo específico estiver presente no soro-teste, a aglutinação dos eritrócitos vai ser inibida e essas células irão rolar e sedimentar, formando um botão. Células que se aglutinam, ao contrário, irão formar uma camada fina sobre o fundo da cavidade, ou em formando botão de bordas irregulares. O soro-teste freqüentemente contêm inibidores inespecíficos da hemaglutinação; e deve ser adsorvido com eritrócitos antes do teste.

Fixação de complemento (FC)

Uso: detecção e quantificação de anticorpos.

Os testes de FC são especialmente úteis como métodos auxiliares no diagnóstico de infecções agudas ou recentes, pois detectam principalmente IgM, a primeira classe de imunoglobulinas a ser produzida em resposta à infecção.

O teste envolve o uso de antígeno viral, complemento obtido de cobaios e um sistema indicador de eritrócitos sensibilizados de ovinos. A sensibilização dos eritrócitos é realizada pela sua incubação com anticorpos específicos, chamados de hemolisina, produzidos em coelhos. O antígeno e o complemento são titulados e diluídos. Se o soro-teste não contêm anticorpos específicos para o agente, o complemento fica livre para reagir com os eritrócitos sensibilizados, produzindo lise. A presença de anticorpos em quantidade suficiente produz a formação de complexos antígeno-anticorpo, que seqüestram o complemento, não permitindo que este produza lise dos eritrócitos.

Imunodifusão

Uso: detecção de anticorpos específicos ou antígenos.

As duas técnicas mais usadas de imunodifusão são o sistema de difusão dupla e a imunoeletroforese. Os dois testes são realizados em meios semi-sólidos, geralmente ágar ou agarose. A diferença principal entre os dois testes é que na imunoeletroforese o antígeno é previamente separado por eletroforese, e então recoberto com um gel contendo o anticorpo. Nos dois testes, o antígeno e os anticorpos se difundem no gel de ágar, formando uma linha de precipitação no local onde se encontram e reagem.

A imunodifusão dupla é um dos testes sorológicos mais utilizados em diagnóstico. O melhor exemplo é o teste de Coggins para a anemia infecciosa eqüina.

O teste de imunodifusão pode ser tornado mais sensível utilizando-se um marcador radioativo, possibilitando a detecção de complexos antígeno-anticorpo que não são visíveis a olho nu. O isótopo iodo (I125) é o marcador mais utilizado, tanto para marcar o antígeno como os anticorpos. A marcação ocorre pela incorporação do I125 no amino-ácido tirosina.

Os resultados são obtidos pela exposição do gel ou lâminas a um filme de raios X que captura as linhas radioativas (precipitação).

Testes de proteção

Uso: identificação de vírus

Os testes de proteção são utilizados para a identificação de vírus quando outros métodos mais simples não são disponíveis. Eles envolvem a indução de imunidade ativa ou passiva em animais seguido de desafio com o agente em questão.

Um exemplo foi o teste de proteção utilizado para a identificação do vírus da peste suína clássica. O teste foi realizando inoculando-se soro hiperimune específico simultaneamente com sangue ou suspensão de baço de um animal suspeito de estar infectado. Se o agente fosse o vírus da peste suína clássica, a imunidade passiva produzida pelo anti-soro anti-vírus da peste suína clássica protegeria o suíno do desafio. Os animais desprotegidos contrairiam a doença.

Hibridização de ácidos nucléicos

Uso: detecção de ácidos nucléicos DNA ou RNA virais em amostras clínicas.

A hibridização de ácidos nucléicos consiste das seguintes etapas:

• O ácido nucléico de cadeia dupla de um vírus é desnaturado com substância alcalina para a separação das cadeias.
• As cadeias simples do ácido nucléico são imobilizadas em um suporte sólido, geralmente uma membrana de nylon ou nitrocelulose, para impedir que as cadeias de se reassociem. O ácido nucléico se liga na membrana através da cadeia lateral de fosfatos; as bases nitrogenadas projetam-se externamente.
• Uma sonda (DNA de fita dupla ou RNA; de origem conhecida – contendo a seqüência de nucleotídeos específica àquela do vírus alvo – conjugada com um isótopo radioativo ou enzima) é incubada com a membrana.
• Ocorre a formação de pontes de hidrogênio entre as bases complementares. As sondas que não se ligaram são removidas por lavagem e a hibridização é detectada através de um método de detecção da sonda.

Vários tipos de hibridização em suporte sólido são utilizados:

Hibridização Southern. Técnica utilizada para a detecção de um fragmento de DNA específico.

Hibridização Northern. Utilizada para detectar-se seqüências despecíficas de RNA.

Hibridização Dot blot. Procedimento similar ao Southern e Northern, pode ser utilizado tanto para DNA como para RNA. A diferença é que o ácido nucléico-alvo é imobilizado em focos (pontos) na membrana, similar aos de uma placa de microtitulação.

Hibridização in situ. O princípio é semelhante ao Southern e Northern hibridização (detecção de um sequencias de nucleotídeos específicas através de sondas marcadas), com a diferença que, ao invés do material suspeito ser extraído e imobilizado em membranas de nitrocelulose, a detecção é realizada diretamente em cortes histológicos do tecido ou células. Essa técnica tem uso limitado em diagnóstico mas é muito útil em pesquisa e estudos de patogenia.

As técnicas de análise de restrição enzimática, reação da polimerase em cadeia e microarranjo são particularmente úteis e são discutidas a seguir.

Análise de restrição enzimática (REA)

Uso: identificação de vírus especificos.

A análise de restrição enzimática (REA) utiliza enzimas chamadas endonucleases de restrição para traçar o perfil da seqüência do genoma dos vírus. A presença de mutações e/ou variabilidade genética em determinados pontos de clivagem no genoma de alguns isolados do vírus resulta em diferentes padrões de clivagem, quando são separados em gel de agarose. Essa análise é chamada de anãlise de polimorfismo de tamanhos de fragmentos (RFLP) e tem sido utilizada para caracterizar e comparar entre isolados de campo de um determinado vírus.

A técnica requer grande quantidade de DNA total ou parcialmente purificado, um grupo de enzimas para clivar o DNA, a capacidade de separar os fragmentos de DNA resultantes por eletroforese e um método de documentar os resultados.

A restrição enzimática de vírus com genomas grandes como o citomegalovírus, pode resultar em 20 a 50 fragmentos de DNA, enquanto vírus com genomas pequenos, como os adenovírus, geralmente produzem 5 a 10 bandas de DNA. Não é fácil, nem é sempre necessário, correlacionar o padrão de clivagem (mais ou menos bandas) com mutações em sítios específicos do genoma, sem a realização de estudos extensivos de hibridização ou mesmo o seqüenciamento dos genomas comparados.

Uma limitação importante do método é a de que a presença da mutação nó será detectada se ocorrer exatamente em um dos locais reconhecidos e clivados pelas enzimas utilizadas. O uso de várias enzimas simultaneamenteaumenta a probabilidade de detectar-se mutações em um determinado genoma ou parte do genoma.

Reação da polimerase em cadeia (PCR)

Uso: detecção/identificação de vírus específicos ou genes específicos.

A reação da polimerase em cadeia (PCR), método in vitro de replicação de DNA, é capaz de amplificar (multiplicar) segmentos de DNA mais de um milhão de vezes. Uma cópia única do genoma viral – se presente na amostra clínica – é amplificada, produzindo milhões de cópias que então podem ser facilmente detectadas por eletroforese. Isso é obtido através da criação de uma reação que, além da amostra de DNA (que potencialmente contêm o DNA-alvo do vírus), contêm dois oligonucleotídeos (primers) com seqüências complementares as extremidades opostas de cada uma das cadeias da seqüência alvo, deoxinucleotídeos trifosfato e uma enzima DNA polimerase termoestável (Taq polimerase).

A mistura é então submetida a uma série de ciclos de temperatura para permitir e facilitar a replicação do DNA e conseqüentemente multiplicar o DNA. A seguir é descrito um ciclo típico:

• A primeira etapa de um ciclo do PCR é a desnaturação do DNA da amostra, pelo aquecimento da reação a 95°C.
• Segundo, a reação é resfriada para permitir a hibridização dos primers na seqüência-alvo de DNA.
• Terceiro, a reação é então aquecida a 72°C para permitir a polimerização do DNA a partir dos primers pela Taq DNA polimerase. Esse ciclo de temperaturas é repetido 35 a 40 vezes. Mais de um milhão de cópias do DNA podem ser obtidas dessa maneira.

Quando o número de ciclos planejado é concluído, o DNA alvo resultante é separado por eletroforese em gel e analisado através da viasulização das bandas de DNA ou através de hibridização Sorthern com sondas específicas.

Vários testes diagnósticos baseados em PCR são comercialmente disponíveis.

A PCR pode ser utilizada também para o estudo de vírus RNA pelo uso da enzima transcriptase reversa que produz cópias cDNA a partir alvo RNA. Essa técnica é chamada de transcriptase reversa, RT-PCR. Outras variações da PCR incluem a PCR em tempo real, na qual a análise espectrofotométrica dos produtos é realizada simultaneamente à reação; e a PCR aninhada (nested-PCR) que utiliza dois conjuntos de primers, sendo um conjunto específico para uma região interna à amplificada pelo primeiro conjunto. Cada uma dessas variações são úteis quando a quantidade de ácido nucléico é muito pequena. A eficácia da PCR em tempo real para diagnóstico em amostras clínicas ainda não foi estabelecida.

Radioimunoensaio

Uso: detecção de antígeno ou anticorpos.

Atualmente, o radioimunoensaio é raramente utilizado em laboratórios de diagnóstico virológico.

Existem dois tipos de RIA: em fase líquida e em fase sólida. No sistema em fase líquida, os complexos antígeno-anticorpo são precipitados pela adição de anti-imunoglobulinas. O precipitado é coletado por centrifugação e seco. A quantidade de radioatividade no precipitado, comparada com a radioatividade total, é a quantificação da reação antígeno-anticorpo. A marcação é realizada com I125 (veja imunodifusão), em qualquer um dos três componentes da reação.

No sistema de fase sólida, o anticorpos é imobilizado na superfície interna de um tubo de poliestireno e então adicionado do antígeno. Resumidamente, o material clínico é adicionado ao tubo previamente recoberto internamente com o anticorpo específico. Se o antígeno está presente, liga-se no anticorpo adsorvido. Após lavagem, um anticorpo anti-viral marcado com 125I é adicionado, reagindo com o complexo imobilizado num efeito "sanduíche". O tubo é lavado e a quantidade de radioatividade é determinada.

Embora as técnicas de detecção de antígeno descritas acima são utilizadas com primeiro teste diagnóstico, muitas vezes essas técnicas não são aplicáveis pois amostras clínicas apropriadas não puderam ser obtidas de animais vivos. Da mesma forma, técnicas rápidas de detecção de antígeno não são disponíveis para vários vírus. Nesses casos, recorre-se ao isolamento viral.

Microarranjo (microarray)

Uso: identificação de vírus específicos ou seqüências virais específicas.

O desenvolvimento dos "microaranjos" foi impulsionado pela aplicação da tecnologia de robótica na rotina da biologia molecular, mais do que por qualquer avanço tecnológico. As técnicas de Southern e Northern blot para a detecção de DNA e RNA mensageiro serviram de base tecnológica para a hibridização em microarranjo.

A construção dos microarranjos envolve a deposição de seqüências específicas de DNA em pontos na superfície de uma lâmina de vidro ou chip de sílica através de robótica. Um único chip pode conter até 50.000 genes. Os chips (ou lâminas) são então expostos a uma fonte de DNA marcado com substância fluorescente. Um computador monitora a fluorescência nos diferentes pontos da superfície do chip, indicando onde o DNA marcado se ligou no DNA imobilizado na lâmina/chip. Como milhares de seqüências de DNA podem estar presentes no chip, é possível através deste teste analisar vários patógenos simultaneamente. Isso é particularmente importante para a detecção de microrganismos usados como armas biológicas e diagnóstico de doenças. Vários microarranjos são comercialmente disponíveis, como o CapitalBio_SARSarrayTM-1.8 Sistema de Detecção para identificar estágios precoces de infecção pelo vírus da SARS (capítulo 24).

Além dos microarranjos de ácidos nucléicos, microarranjos de proteínas também têm sido utilizados. Nesses casos, procura-se proteínas específicas.

Coleta e remessa amostras

O diagnóstico laboratorial de uma doença clínica depende em grande parte do tipo e condição do material submetido. Depende também da ação coordenada do veterinário de campo e do técnico laboratorial. Devido ao fato da maioria dos testes laboratoriais serem específicos para um determinado agente, um histórico clínico adequado deve acompanhar todos os materiais submetidos. Isso permite ao pessoal do laboratório realizar testes adicionais, se necessário e indicado.

Regras gerais de coleta e remessa de material são apresentadas a seguir. A maioria dos laboratórios fornece um formulário de remessa de amostras que deve ser preenchido com as informações pertinentes. Na ausência desse formulário, o veterinário deve fornecer um histórico o mais completo possível. Devem, entrar em contato com o laboratório para esclarecer quaisquer dúvidas.

Animais

Animais vivos, doentes, devem ser preferidos aos de animais mortos. Sempre que possível, esses animais devem ser enviados ao laboratório para um exame e necropsia completos. Se o problema afeta um rebanho, mais de um animal deve ser enviado. Ônibus e transportadoras podem ser utilizados para transportar animais de pequeno porte, desde que acondicionados apropriadamente em caixas ou embalagens apropriados à prova de vazamentos. Não congele animais a serem submetidos para a necropsia.

Tecidos

Para evitar contaminação durante a necropsia, recomenda-se coletar uma série de tecidos antes de realizar-se um exame minucioso. Órgãos/tecidos recomendados para se coletar são: pulmão, rins, fígado, baço, intestino delgado e grosso, linfonodos regionais. O cérebro ou a cabeça devem ser coletados em suspeita de doença do sistema nervoso central. Outros tecidos que contenham lesões observadas durante o exame também devem ser coletados. Uma porção de cada tecido deve ser acondicionada em sacos plásticos impermeáveis e refrigerados. Cada tecido/órgão deve ser preferencialmente acondicionado em um saco individual. Segmentos de intestino devem ser obrigatoriamente acondicionados em separado, para se evitar contaminação bacteriana, pois senão e xame bacteriológico será comprometido.

Tecidos coletados próximo ao final de semana devem ser enviados na próxima segunda-feira.

Devido ao fato de que muitos vírus produzem lesões características microscópicas pequenos fragmentos (0.5 cm de espessura) de cada tecido devem ser acondicionados em frascos com formol tamponado a 10% para exames histológicos. Em casos de doença neurológica, recomenda-se enviar uma metade longitudinal do cérebro. Essas amostras não devem ser congeladas.

Fezes

Fezes devem ser coletadas de animais doentes e acondicionadas em frascos hermeticamente fechados. Embora swabs saturados em fezes sejam adequados para alguns exames virológicos individuais, algumas gramas de fezes permite um espectro maior de exames, incluindo bacteriológico e parasitológico. AS amostras devem ser submetidas ao laboratório utilizando gelo reciclável.

Swabs

Swabs nasais e oculares são úteis para o isolamento de vírus de animais com doença do trato respiratório superior. Infecções genitais também podem ser diagnosticadas pelo exame de swabs coletados do trato reprodutivo (vulva, vagina, pênis, prepúcio). Os swabs devem ser coletados de animais com a infecção aguda e acondicionados diretamente em tubos contendo um meio de transporte para vírus. A coleta de material de vários animais, em diferentes estágios da infecção, aumenta a probabilidade de isolamento do agente. Swabs são úteis também para coletar-se amostras de lesões vesiculares. Vesículas frescas devem ser rompidas e os swabs embebidos com o conteúdo. Dois swabs devem ser sempre coletados, um para microscopia eletrônica e outro para o isolamento de vírus. O swab para isolamento deve ser acondicionado em meio de transporte e o swab para microscopia eletrônica deve ser colocado em um tubo contendo um pequeno volume (uma a duas gotas) de água destilada. Material descamativo de lesões mais avançadas também deve ser submetido.

Existem vários meios comercialmente disponíveis que auxiliam a manter a viabilidade dos vírus durante o transporte ao laboratório.

A maioria desses meios contém solução iônica balanceada, proteínas e antibióticos para impedir proliferação bacteriana. Vários laboratórios fornecem seus próprios meios de transporte quando requisitados por veterinários de campo.

Lâminas

Várias doenças infecciosas podem ser diagnosticadas pelo exame de lâminas preparadas a partir de sangue ou tecidos. Esfregaços sanguíneos são utilizados para o diagnóstico da leucemia felina, enquanto esfregaços sanguíneos e raspados conjuntivais são usados no diagnóstico da cinomose. Raspados conjuntivais são particularmente úteis no diagnóstico de infecções por herpesvírus e clamídias em gatos. Impressões do fígado, baço e pulmões são especialmente úteis no diagnóstico de infecções por clamídias e herpesvírus em psitacídeos.

As lâminas devem conter um número suficiente de células para permitir um exame detalhado, mas não devem se muito espessas a ponto de dificultar a coloração. Um raspador conjuntival ou outro aparelho (borda cega de uma lâmina de bisturi ) podem ser usados para raspar a conjuntiva; swabs de algodão não são adequados. Sacos conjuntivais purulentos ou com secreção contaminada devem ser lavados antes da coleta do raspado. Impressões de tecido devem ser feitas através de pressão leve do tecido (previamente adsorvido em papel-toalha para remover o sangue) contra a superfície da lâmina.

As lâminas devem ser secas ao ar e remetidas ao laboratório em suportes especiais para prevenir a sua quebra. O envio de várias lâminas permite um exame mais detalhado, incluindo citológico.

Soro

Amostras de sangue devem ser coletadas em tubos estéreis sem anticoagulante. Estes devem ser enviados ao laboratório em caixas de isopor com gelo, em estantes para impedir que se rompam. Amostras de sangue não devem ser congeladas ou aquecidas em excesso. Se as amostras não puderem ser enviadas ao laboratório em poucas horas, o soro deve ser separado e refrigerado ou congelado.

Glossário

Aliquoted:
Divided (as a solution) into equal parts.

Primers:
pequenas seqüências de DNA ou RNA utilizados como iniciadores para a síntese de ácido nucléico. O primer hibridiza com a sua região complementar na molécula molde do ácido nucléico e fornece a oxidrila 3’ para o início da síntese. Os primers delimitam a região que vai ser amplificada. Na PCR, dois primers (as vezes mais) oligonucleotídeos sintéticos (em torno de 20 nucleotídeos) são complementares a regiões nas cadeias opostas flanqueiam a região alvo; as extremidades oxidrila 3’ são orientadas uma na direção da outra. Na PCR, a seqüência alvo em uma amostra é geralmente de 100 a 2000 pares de bases de extensão. Primers desenhados e arbitrários podem ser usados.

Testes regulatórios:
são testes realizados por imposição de legislação oficial de órgãos governamentais para doenças animais de interesse sanitário estratégico.

Endonuclease de restrição:
são enzimas derivadas de bactérias, que reconhecem e cortam o DNA em sequencias específicas.

Polimorfismo de tamanhos de fragmentos (RFLP):
revelam muitas diferenças no DNA entre indivíduos de uma mesma espécie. RFLPs resultam da clivagem do DNA por enzimas de endonucleases de restrição, separação dos fragmentos por eletroforese e visualização das bandas (fragmentos de DNA) pela coloração com brometo de etídio.

Taq polimerase:
DNA polimerase utilizada na PCR. É derivada de uma bactéria aquática denominado Thermus aquaticus que vive em águas de gêisers; a termoestabilidade da enzima permite seu uso na PCR.