Cultivo e caracterização viral

Ìndice

• Métodos de propagação de vírus
• Purificação e concentração de vírus
• Armazenagem e infectividade
• Visualização de vírus
• Contagem direta de partículas víricas
• Contagem indireta de partículas víricas
• Alguns métodos empregados para a caracterização de vírus
• Glossário

Vários métodos para o armazenamento, visualização, quantificação (direta e indireta) e propagação de vírus foram desenvolvidos. Existem também métodos para a realização do diagnóstico de doenças produzidas pela infeções víricas, muitos deles são baseados em testes sorológicos, os quais detectam a resposta do hospedeiro ao agente. Os métodos de diagnóstico serão discutidos no Capitulo 7.

Historicamente foi observado que alguns agente causadores de doenças poderiam passar através de filtros nos quais as bactérias eram retidas. Os filtrados quando inoculados em meios seletivos para bactérias apresentavam resultado negativo para esse microorganismo, porém mantinham a capacidade infectante e eventualmente continham vírus. Normalmente não é possível observar os vírus com com o uso de microscópio óptico, com execção dos poxvírus. A visualização de partículas víricas somente pode ser feita com o uso de microscópio eletrônico. Alguns métodos básicos aplicados para o estudo de vírus serão descritos abaixo.

Como discutido no capítulo anterior, existe uma considerável diversidade nas características físicas dos vírus de animais. A principal característica que reflete a diversidade viral é a presença ou ausência do envelope. Como demonstrado na Tabela 2.1, os vírus não-envelopados de uma maneira geral são sensíveis a radiação ultravioleta, relativamente termoestáveise susceptíveis a danos produzidos pelos cristais de gelo.

Devido a presença de camada lipídica que compõe o envelope viral, os vírus envelopados são inativados por solventes lipídicos (clorofórmio e éter) e detergentes (deoxicolato), são sensíveis as radiações ultravioletas e gama, relativamente termosensíveis e mais facilmente danificados por cristais de gelo do que os vírus que não possuem envelope.

Métodos de propagação viral

Para o isolamento, caracterização, identificação e produção de vacinas uma considerável quantidade de partículas víricas é geralmente necessária. Isso pode ser obtido pela através de técnicas de propagação.

Inoculação de animais

Durante muito tempo a inoculação de susceptíveis foi única maneira de se obter grande quantidades de vírus. Atualmente, o uso de animais para multiplicação de vírus é limitada devido a questões éticas. Somente utiliza-se animais para a amplificação viral para aqueles vírus que apresentam dificuldade de adaptação ao cultivo celular. Por exemplo, cepas vacinais do vírus da Enterite Hemorrágica dos Perus podem ser propagadas em animais ou em cultivo celular. No entanto, o uso de amostras oriundas do baço de aves parece ser mais empregada.

Com o propósito de diagnóstico, a inoculação de animais pode ser utilizada, em amostras suspeitas de raiva utiliza-se a inoculação de camundongos lactantes.

Inoculação de ovos embrionados

Previamente ao desenvolvimento das técnicas de cultivo celular, o uso de ovos embrionados para a propagação viral foi umas das primeiras alternativas na qual não se utilizava animais. A inoculação em ovos embrionados é um método amplamente utilizado para a propagação de vírus influenza tipo A e a maioria de vírus aviários. Esse sistema pode ser empregado para a diferenciação de alguns vírus que produzem lesões semelhantes, como vírus do cowpox e do pseudocowpox. No entanto, alguns vírus de mamíferos, como o vírus da Língua Azul, se adaptam bem a esse sistema que é rotineiramente utilizado para propagação, diagnóstico e pesquisa.

Algumas considerações devem ser tomadas quando do emprego dessa técnica, dentre elas a presença de anticorpos maternais (IgY) no saco da gema. Devido a isso, é indicado o uso de ovos oriundos de criatórios SPF (specific pathogen-free – livres de patógenos específicos). A constante passagem de viroses em ovos embrionados também é uma técnica de atenuação que pode ser aplicada para a obtenção de amostras virais utilizadas em vacinas vivas modificadas.

Cultura de células e tecidos

A cultura de tecidos refere-se ao crescimento e manutenção de tecidos vivos in vitro. Existem dois tipos básicos: cultivo de explante e cultivo celular. Cultivo de explantes são pequenos fragmentos de tecidos oriundos do hospedeiro e mantidos em cultivo, enquanto que o cultivo celular é resultado da dissociação do tecido em células individuais seguido de sua manutenção em cultivo. Vários sistemas utilizados em virologia são baseados no emprego de cultivos celulares e não na cultivo de tecidos, sendo muitas vezes ambos termos aplicados indiscriminadamente. O cultivo de células pode ser subdividido em cultivo primário, semi-contínuo e contínuo ou linhas celulares.

Figura 2-1. Cultivo celular normal. Cortesia do A. Wayne Roberts.

Cultivos de explante

São culturas de pequenos fragmentos de tecidos específicos retirados de animais. Cultivos de explante são úteis para isolamento viral e são necessários para o isolamento de alguns coronavírus. Demonstração de latência por alfaherpesvírus humanos e animais podem exigir o uso de cultivos de explantes de ganglios nervosos (trigêmeo).

Cultivo celular primário

Cultivo de células primárias são originados de tecidos frescos que foram submetidos ao tratamentos com enzimas (tripsina ou outras proteases) para a individualização das células. Como resultado, esse tipo de cultivo muitas vezes é composto de vários tipos celulares. Nas condições in vitro, os cultivos primários raramente se dividem ou então o fazem a uma freqüência muito baixa, isso é denominado como limite de Hayflick. Portanto, são limitados quanto ao número de passagem, porém são ideais para o isolamento de alguns vírus. Cultivos primários raramente sobrevivem a 20 passagens in vitro.

Cultivo semi-contínuo

Conhecido como linha celular diplóide, o cultivo semi-contínuo contém o número normal de cromossomos de uma célula diplóide da espécie da qual foi originado. Cultivos semi-contínuos são originados de cultivos primários na qual algumas células podem sobreviver mais que o limite de Hayflick. Esse tipo de cultivo geralmente sobrevive entre 30 e 50 passagens in vitro. No entanto, esses cultivos são amplamente para a propagação de uma grande variedade de vírus. Geralmente são compostos por fibroblastos.

Cultivo contínuo ou linhas celulares

As células desses tipo de cultivo apresentam um número anormal de cromossomos, sendo chamados de cultivos heteroplóides. Essas células são originadas de tecidos normais ou neoplásicos e são caracterizados pela habilidade de propagação indefinida in vitro. Geralmente, os cultivos contínuos ou linhas celulares são menos susceptíveis a propagação viral do que os cultivos primário ou semi-contínuo. Porém, possuem a facilidade de multiplicação em grande escala o que é benéfico para a pesquisa e produção de vacinas. Muitas linhas celulares estão disponíveis em repositórios, como o American Type Cell Culture (ATCC).

Os laboratórios de virologia geralmente mantém estoques de linhas celulares com um baixo número de passagens, pois essas linhas contínuas são susceptíveis a alterações nas suas características. As alterações podem ser produzidas pela infeção com micoplasmas ou contaminação com alguns vírus (circovírus suíno e vírus da diarréia viral bovina).

Concentração e purificação viral

Após a adaptação e propagação inicial, os vírus podem ser separados dos debris celulares e purificados. Isso é obtido após um número de processos que envolvem centrifugações (diferentes velocidades), diálise, precipitação, cromatografia e gradientes de densidades. O passo inicial desse processo é um centrifugação diferencial (baixa velocidade) (~ 2000 x g) que é usada para remover o debris celulares. O seguinte passo é uma centrifugação a alta velocidade (40 000 a 80 000 x g) que objetiva reduzir o volume da amostra, em alguns casos em que deseja reduzir o volume ainda mais pode ser feita uma concentração por diálise e precipitação com metanol ou polietilenoglicol realizada a baixa temperatura (-70°C). A purificação é obtida através de cromatografia ou centrifugação através de gradientes de densidade. Vírus envelopados podem ser purificados através da velocidade de sedimentação em gradientes de sacarose. Já os vírus não envelopados, podem ser purificados pela centrifugação em gradientes de cloreto de césio.

Infectividade e armazenamento

Infectividade

Infectividade é a habilidade que o vírus tem de infectar uma célula hospedeira. A temperatura exterior à célula hospedeira afeta diretamente a capacidade do vírus manter a sua infectividade, particularmente nos casos do vírus envelopados. Os vírus não possuem atividade metabólica própria, a infectividade é a maneira de avaliar a integridade da partícula após a exposição a determinadas temperaturas. Alguns parâmetros são considerados críticos:

• à 60°C, a infectividade irá diminuir rapidamente em segundos.
• à 37°C, a infectividade irá diminuir em minutos.
• à 20°C, infectividade irá diminuir em horas.
• a infectividade, à temperaturas acima citadas, irá influenciar a transmissão pelo contato direto (à 37°C) e pelos fomites (à 20°C).
• à 4°C, a infectividade nos tecidos é mantida por dias. Clínicos devem estar atentos para esse tipo de amostra clínica.

Temperaturas abaixo da temperatura de congelamento são usadas para armazenamento de vírus durante prolongados períodos. Nesse caso é importante manter a formação de cristais de gelo à níveis mínimos.

Deve ser considerado que a resistência e labilidade varia muito entre os vírus. Alguns são capazes de resistir por horas, dias, ou até meses em condições ambientais, enquanto outros sâo inativados em minutos sob condições semelhantes.

Três métodos principais de conservação de vírus são:

• congelamento à -70°C com ou sem criopreservantes.
• congelamento à -196°C nitrogênio líquido, para armazenamento por um longo período de tempo.
• liofilização ou congelamento a seco, podendo ser estocados a temperatura ambiente ou congeladores convencionais

Visualização de vírus

Os dois métodos mais utilizados para visualizar a estrututra e morfologia dos vírus são a microscopia eletrônica e microscopia de força atômica. Outros tipos de microscopia são empregados para observar as alterações celulares induzidas pela replicação viral. Sem as técnicas de visualização dos vírus existe uma dificuldade muito grande em se estudar a estrutura ou a interação vírus-célula. A capacidade de visualização das partículas permitiu se estimar o número de partículas presentes em uma suspensão. Alguns métodos permitem estimar o número de partículas presente em uma solução de forma indireta. Em ambos os casos, direta ou indireta, a quantificação é sempre uma estimativa. A estimativa é importante na preparação de vacinas, na determinação do número mínimo para produção de doença ou em investigação viral.

Microscopia óptica

Com o uso da microscopia óptica não é possível a observação das partículas víricas, com exceção dos poxvírus, esta técnica pode ser utilizada para a observação do efeito da infecção viral na células hospedeira. A alteração ou destruição causada pelo vírus nas célula é referido como efeito citopático (CPE). Os efeitos citopáticos observáveis incluem:

1. arredondamento celular e agregados semelhantes a cachos de uva. Ex.: adenovírus
2. arredondamento celular, retração celular, ruptura com a liberação de debris celulares. Ex.: enterovirus
3. entumecimento e arredondamento celular em áreas localizadas. Ex.: herpesvírus
4. fusão de várias células e formação de células gigantes multinucleadas (sincício). Ex.: paramixovírus

Adicionalmente, a formação de corpúsculos de inclusão pode ser observada, sendo características de alguns vírus.

Figura 2-2. Efeito citopático de um herpesvírus equino "lento". Cortesia do A. Wayne Roberts..

Microscopia de fluorescência

A microscopia de fluorescência pode ser utilizada para a visualização de células ou tecidos infectados por vírus, nesse caso emprega-se anticorpos específicos para o antígeno associados a um fluorocromo (geralmente fluoresceína). Os anticorpos ligam-se especificamente nos antígenos virais dentro das células ou tecidos. A visualização é possível após a excitação do fluorocromo com a luz ultravioleta (UV) do microscópio de fluorescência, na qual observa-se a áreas coloridas localizadas em um fundo relativamente escuro. Alternativamente, a visualização pode ser realizada indiretamente através do uso de anticorpos não marcados (específicos para o antígeno, como os soro de animais convalescentes), seguido do uso de um anticorpo marcado com o fluorocromo que reconhece o primeiro anticorpo. As técnicas que utilizam anticorpos fluorescentes são rotineiramente usados no diagnóstico e pesquisa viral.

Microscopia eletrônica

A microscopia eletrônica emprega a aceleração dos elétrons com grande energia e magnéticamente, tornando possível a visualização da amostra. Os elétrons com alta energia possuem comprimentos de ondas curtos e isso faz com se obtenha uma melhor resolução de estruturas muito pequenas. A microscopia eletrônica possui resolução capaz de se visualizar grandes polímeros, como DNA, RNA e grande proteínas.

Para facilitar a visualização, as amostras podem ser previamente tratadas com metais pesados, como o ósmio. Os elétrons chocam com o metal, os quais são visualizados na tela fluorescente. Com microscopia eletrônica é possível a obtenção de imagens tridimensionais dos vírus e de sua localização dentro da células hospedeira (núcleo ou citoplasma) em um determinado momento após a infeção. Como as amostras são tratadas com metais pesados, a observação dos vírus em células vivas não é possível.

Microscopia atômica de força

A microscopia de atômica de força mede a propriedades locais (tamanho, absorção, magnetismo, etc.) mediante a proximidade da sonda com a amostra. Isso faz com que seja possível medir pequenas áreas da amostra. Os elétrons são impulsionados entre os átomos, resultando em uma pequena, mas mensurável força. O resultado da força medida é transformado no contorno da superfície da estrutura analisada.

A vantagem da microscopia atômica de força é o uso de células ou tecidos vivos e de requerer uma quantidade mínima de amostra. Esse método tem sido útil para imagens detalhadas de estruturas de capsídeos e de interações entre o vírus e a célula

Microscopia imunoeletrônica

Essa técnica permite a visualização do complexo antígeno/anticorpo que é específico para determinado vírus. Nesse método, seções ultrafinas da amostra são preparadas e incubadas com um anticorpo específico para o vírus. Após seguidas lavagens, a seção é incubada com proteína A conjugada com partículas de ouro (com um tamanho variando entre 5 e 20 nm). A de proteína A liga-se à região Fc do anticorpo e a detecção é feita com o uso da microscopia eletrônica.

Contagem direta de vírus

A contagem do número de partículas víricas possui importância na pesquisa e produção de vacinas. A microscopia eletrônica é usada para contagem de partículas víricas em soluções livres de vírus. Um determinado volume de amostra é examinado e os vírus são contados. Esse número é então empregado para se fazer uma estimação do número total de partículas na amostra. Uma limitação desse método é que capsídeos vazios, partículas não infecciosas, são contadas. O número de partículas infecciosas e o número total são comparados possibilitando o estabelecimento de uma relação partículas totais/partículas infecciosas para uma determinada preparação de um vírus.

Contagem indireta de vírus

Os métodos de contagem indiretos utilizam fatores associados com a infectividade (atividade biológica). Os três principais métodos utilizados para a determinação da concentração viral são: provas de hemaglutinação, prova de formação de placas e o método da diluição limitante.

Hemaglutinação

A prova de hemaglutinação é baseada na propriedade que muitos vírus envelopados tem de aglutinar eritrócitos. O teste é realizado em microplacas e consiste da adição de células vermelhas à diferentes concentrações do vírus, após um período de incubação o observa-se a hemaglutinação. A hemaglutinação é o resultado da ligação de várias partículas víricas à superfície do eritrócito. Por exemplo, são necessários 10000 partículas víricas de influenza por cada unidade hemaglutinante (HA). Uma HA é definida como a maior diluição da amostra viral que produz hemaglutinação completa.

A hemaglutinação é empregada para a concentração e purificação de alguns vírus, e também como um teste auxiliar na identificação de alguns vírus em amostras de cultivo celular e fluídos de embriões de galinhas. Especialmente de amostras víricas que não efeito citopatogênico ou então o fazem de forma discreta. Pode ser utilizada diretamente em amostras de fezes ou para determinados tipos de ensaios enzimáticos (discutido no capítulo 7). Ensaios similares de atividade enzimática de um vírus em particular (como aqueles que possuem transcriptase reversa) podem ser realizados de maneira semelhante.

Unidade formadora de placas

Esta prova baseia-se na inoculação de células susceptíveis com uma amostra do vírus e através da sua atividade biológica pode-se estimar a quantidade de partículas.

Nesse procedimento, diluições seriadas na base dez do vírus a ser testado são inoculadas em camadas celulares. Após o período de incubação que permite o vírus adsorver nas células, é adicionada um gel contendo agarose e meio de cultivo. O ágar previne a disseminação do vírus na cultura entre as células a uma grande distância, mas permite que ocorra uma transmissão célula-a-célula. Nos vírus citopáticos, as células infectadas serão destruídas formando um área clara indicando a morte celular após a um período de incubação que pode variar entre 24 - 72 horas. O cálculo do número de placas baseia-se na contagem do número de placas observadas, no fator de diluição e no volume de amostra usada para, resultando em Unidade Formadora de Placas por mililitro de amostra.

Método da diluição limitante

Esse ensaio é baseado na observação da presença da replicação viral in vitro como CPE após a exposição de diferentes diluições da amostra a ser testada. Quando possível, utiliza-se um vírus referência que possuí a sua concentração pré-determinada como controle positivo. Dependendo do vírus, realiza-se diluições seriadas na base dois ou na base dez e incuba-se com células susceptíveis. O título infecioso (a recíproca da maior diluição capaz de infectar 50% das culturas celulares) é expresso como DICC50/ml (dose infectante para 50% dos cultivos celulares). Essa prova pode ser realizada com culturas celulares, ovos embrionados ou até mesmo com animais de laboratórios.

Diferentes métodos usados para caracterização

Existem algumas técnicas utilizadas em virologia que são auxiliares na identificação e classificação de amostras desconhecidas de vírus. Algumas das técnicas serão rapidamente citadas, mas se possuem especial interesse no diagnóstico ou pesquisa de algum particular vírus serão descritas com mais detalhes na ocasião apropriada.

Sensibilidade a solventes lipídicos

A sensibilidade de alguns vírus aos solventes lipídicos, como clorofôrmio e éter, auxilia na taxonomia de alguns vírus. Todos os vírus que possuem a envelope são susceptíveis aos solventes lipidícos membrana externa. Todos os vírus animais envelopados, com exceção de alguns poxvírus, são sensíveis ao éter.

IIdentificação do ácido nucléico

A identificação é realizada através da síntese do ácido nucleico na presença de inibidores da síntese do DNA, tais como 5-bromo-2-deoxyuridine (BrdU). Se a síntese viral for inibida, a multiplicação do vírus estará diminuída então do mesmo modo. Caso a multiplicação viral não for inibida, presume-se que o vírus contenha RNA como material genético.

Análise por enzimas de restrição

Enzimas de restrição são endonucleases (RE) que cortam o DNA de fita dupla em regiões específicas, variando de quatro a oito seqüências de bases palindrômicas.

A análise por enzimas de restrição é particularmente útil para a definição do "subserotipo", na diferenciação entre vacina viva modificada e amostra virulenta, e estudo epidemiológico de surtos. O método baseia-se no tratamento do DNA viral com uma ou mais enzimas de restrição, seguido da separação dos fragmentos de acordo com o tamanho através de eletroforese em gel de poliacrilamida ou agarose.

Os vírus RNA também podem ser analisados através desta técnica, porém primeiro deve ser sintetizado o DNA complementar (cDNA) a partir de RNA usando a enzima transcriptase reversa, seguido de uma amplificação do cDNA pelo uso da técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR), método que será descrito no capítulo 7.

Hemadsorção

Os ortomixovírus e paramixovírus obtém a camada externa do envelope através do brotamento nas membranas celulares. Anteriormente ao brotamento, proteínas codificadas pelos vírus (hemaglutininas) são incorporadas na membrana celular. Isso fará com as os eritrócitos adsorvam na superfície celular, e resultando na formação de um foco de hemadsorção que poderá ser detectado microscopicamente.

Métodos imunológicos

Animais infectados com vírus respondem através da produção de anticorpos específicos. A detecção e avaliação desses anticorpos, os quais refletem o estado da doença, são utilizados para o planejamento de programas sanitários em rebanhos e em estudos epidemiológicos de surtos.

A detecção dos anticorpos é também empregada no diagnóstico de doenças, e isso é muitas vezes um processo demorado que requer a avaliação dos níveis de anticorpos na fase aguda e convalescente, geralmente coletados num intervalo de 10 a 14 dias. Uma medida mais rápida é utilizar anticorpos específicos (soro hiperimune) para detectar os antigenos virais diretamente nas amostras clínicas. Esses anticorpos são obtidos através da hiperimunização de coelhos ou cabras com vírus. Outra alternativa que podem ser empregada são os anticorpos monoclonais, se disponíveis.

Anticorpos monoclonais (mAbs) são preparados em camundongos após a sua exposição com o antígeno viral, esses desenvolverão linfócitos B específicos no baço. Essas células serão coletadas e fusionadas quimicamente com a uma linhagem celular de plasmocitomas de camundongos que secretam IgG. Essas células híbridas, são então selecionadas e clonadas, resultando os hibridomas, esses serão analisados quanto a secreção de anticorpos específicos para o antígeno viral. Os hibridomas selecionados são injetados no peritônio de camundongos, onde essas células irão multiplicar rapidamente, resultando no acúmulo de fluído ascítico contendo altas concentrações do anticorpo monoclonal. A figura 2-1 descreve os passos envolvidos na preparação de anticorpos monoclonais. Anticorpos monoclonais são utilizados na tipificação e subtipificação viral. Quando ligados a substâncias fluorocromos, os mAbs são utilizados na detecção de antigenos virais em tecidos. Os mAbs são também usados em testes de ELISAs para a identificação de vírus.

Os testes mais comuns empregados no diagnóstico e pesquisa viral serão discutidos no Capítulo 7.

Figura 2-3. Os passos associados com o desenvolvimento de anticorpos monoclonais específicos.

Glossário

Vírus citopático:
são vírus que alteram a aparência das células em cultura. As alterações podem incluir arredondamento, fusão, lise e liberação e produção de corpúsculos de inclusão.

Gradiente de densidade:
este procedimento é empregado para separação das células ou moléculas grandes, como proteínas e ácidos nucléicos, pela centrifugação através de um gradiente de densidade. O gradiente consiste de uma solução (geralmente por sacarose ou cloreto de césio) formada por várias densidades, sendo a menos concentrada na superfície e a de maior concentração no fundo. Devido a centrifugação as células e moléculas movem-se através do gradiente e formam bandas na densidade onde sua gravidade e igual ao do meio.

Palindrômicas:
são seqüências de DNA que a leitura é a mesma em ambas as direções. A maioria dos sítios de reconhecimento das enzimas de restrição são palindrômicas. Ex.: o sítio de reconhecimento da EcoRI (E. coli) é:

5' GAATTC 3'
3' CTTAAG 5'