Gestación y desarrollo fetal en el búfalo

De acuerdo con el diccionario médico, el período de desarrollo de la cría en los animales vivíparos desde el momento de la fertilización del óvulo hasta el nacimiento se denomina gestación. La palabra parece haberse derivado de la palabra en latín “gestare” que significa “cargar”. Los mecanismos y moléculas involucradas en el establecimiento y finalización de la gestación son complejos y están parcialmente entendidos. La gestación en el búfalo parece ser similar a la del ganado aunque con un mes más de duración. La longitud gestacional en las búfalas varía ampliamente entre las diferentes razas (305-315 días en las de río) [1,3] y tipos (320-340 en las de pantano) [4,5]. El establecimiento de la gestación en rumiantes implica la fertilización secuencial, elongación y eclosión de blastocisto, formación de membranas embrionarias, señales para el reconocimiento de la gestación, implantación, desarrollo de placenta y posterior crecimiento secuencial del feto y el útero hasta el término. Muchos de estos procesos son complejos y poco entendidos en los rumiantes [6,7], y en la búfala, nuestra comprensión es aún menor. Evaluaciones recientes han mencionado que las moléculas implicadas en el reconocimiento de la gestación y el crecimiento embrionario como el interferón-tau [8,9], el reconocimiento materno de la gestación [10], la remodelación endometrial [11,12] y los cambios en los perfiles proteómicos del endometrio [13-15] alargamiento embrionario en el búfalo [16,17], parecen ser similares a los observados en el ganado y aún existen algunas diferencias menores, como el crecimiento de un embrión un día antes a la etapa de blastocisto [18,19], el implante comparativo retrasado [20] y un período de gestación más largo. En este capítulo se presenta la información sobre la duración de la gestación, elongación embrionaria, reconocimiento materno de la gestación, implantación, membranas y fluidos fetales, formación placentaria, proteínas placentarias, cambios endocrinológicos durante la gestación, cambios en los órganos reproductivos, desarrollo prenatal de partes fetales y gemelaridad y la proporción de sexos.

Longitud de la gestación

La duración de la gestación en las búfalas es casi un mes más larga que en las vacas con un rango de 299 a 346 días [21-23]. El promedio de longitud de la gestación en búfalas de Sri Lanka (316.3±6.5 días) es significativamente más largo que el de las búfalas Murrah (309.9±6.5 días) [24]. En un estudio reciente, se registraron longitudes de más de 330 días para búfalos en Sri Lanka [25]. El promedio de la longitud de la gestación en búfalas de la India y Paquistán (305-308 días) [26,27] es 7-10 días más corta en comparación con la de los búfalos egipcios (315-317 días) [21]. Ghanem y col., observaron una diferencia significativa en la longitud de la gestación entre medios hermanos paternos y maternos y propios hermanos. La heredabilidad estimada de la longitud de la gestación fue de 0.32+0.02 para búfalas Murrah [22], 0.06±0.03 para búfalas Nili-Ravi [29] y 0.32+0.13 para búfalas egipcias [30]. Las estimaciones de repetibilidad para la duración de la gestación fue de 0,59 [31] y el coeficiente de correlación entre el peso al nacer del ternero y la duración de la gestación fue de 0,17 [31 La duración de la gestación del búfalo del pantano es considerablemente más larga que la del búfalo de río y puede extenderse de 330 a 340 días [32,33].

Factores que afectan la longitud de la gestación

Dentro de un rango estrecho, los factores tales como el sexo de la cría, estación al parto, peso de la cría al nacer y número de partos de la madre afectan la longitud de la gestación en las búfalas. El factor más sorprendente que afecta la longitud de la gestación en las búfalas parece ser la raza (Tabla 1). Las variaciones en la duración de la gestación de las razas debido a su ubicación geográfica [34] y debido al cruce de búfalos de pantanos y de río [35-38] fueron marginales.

Sexo de la cría

Se ha mencionado en un gran número de informes que en las búfalas las crías macho requieren un tiempo ligeramente más largo (1-2 días) para completar la gestación en comparación con las crías hembra de búfalas de río [39-43] y pantano [36,44-46], aunque algunos informes no encontraron ninguna diferencia entre la longitud de las gestaciones de crías macho y hembra en las búfalas [22,47-49] y algunos observaron longitudes en la gestación más largas en búfalas que portaban crías hembras en comparación con las que portaban crías macho [28,50,51].

Estación al parto

El efecto de la estación al parto sobre la longitud de gestación en las búfalas fue apreciable [2]. Las búfalas que paren en verano y otoño tienen una longitud de gestación más cortos en comparación con aquellas que paren en invierno y primavera [22,26-28,40,42,43,46,48,52-54]. Se sabe que el mes de parto afecta la longitud de la gestación en las vacas. Las vacas Holstein que parieron en julio tuvieron una longitud de gestación más corta en 2 días en comparación con las que parieron en el mes de octubre [55]. Ghanemi, 1998 [56] documentó que las búfalas Iraníes que parían entre diciembre y febrero tenían un período de gestación más largo (318.5 días) comparado con las que parían entre septiembre y noviembre (314.5 días). La razón más probable para que los períodos de gestación sean más cortos durante los meses cálidos del verano podrían ser el estrés medioambiental que produce la liberación de corticosteroides y una inducción más temprana del parto [57].

Peso de la cría al nacer

Las correlaciones positivas entre la duración de la gestación y el peso al nacer del becerro [26,58] sugieren que una menor duración de la gestación daría como resultado un menor peso al nacer de los becerros. El peso al nacer de los terneros búfalos machos (35.98 ± 0.15 kg) es mayor en comparación con las terneras búfalas hembra (30.45 ± 0.14 kg) [5959,60], lo que da como resultado una gestación más prolongada en búfalas portadoras de terneros machos [27,44]. Usmani y col. [27] notó que los terneros búfalos Nili-Ravi que pesaban menos de 25 kg y más de 45 kg al nacer tenían períodos de gestación más largos (312 días) en comparación con los que pesaban entre 25 y 45 kg al nacer (307 días). Otros determinantes del peso de la ternera pueden ser el número de partos de la madre, nutrición y estación. Una cría de búfalo nacida de una novilla de primer parto fue pesó en 5.44 kg menos en comparación con aquellas crías que nacieron de búfalas multíparas. El mayor peso al nacer en búfalos egipcios fue registrado al cuarto parto [31,61]. Las diferencias en el peso al nacer de los terneros también se observaron entre dos razas de búfalos (29.12 ± 0.83 kg para Murrah y 25.46 ± 0.42 kg para no descritas) con longitudes de gestación ligeramente diferentes [41].

Número de partos

El análisis de las diferencias en la duración de la gestación de novillas y vacas de varias razas de ganado reveló que las novillas requerían un período de gestación ligeramente más largo (1 a 3 días) [55]. Las búfalas de Murrah primíparas tuvieron un período de gestación significativamente más largo (312.57 días) en comparación con las búfalas pluríparas (309.60 días) [26]. De manera similar, las búfalas primíparas Nili-Ravi tuvieron un período de gestación más largo en comparación con las búfalas pluríparas [62]. Aunque algunos informes [2,45-47,63] no registraron efectos del número de partos sobre la duración de la gestación de las búfalas, otros estudios [28,31] registraron una menor duración de la gestación en búfalas egipcias al primer parto. Janakiraman [1] observó que la duración promedio de la gestación en las búfalas Surti en su primer, segundo y tercer parto fue de 305, 307 y 310 días. Algunos estudios [43,64] registraron que el número de parto tuvo un efecto significativo sobre el peso del ternero que aumentó del primer al séptimo parto con un ligero aumento en la duración de la gestación (302.24 ± 4.11 en la primera y 315.77 en el séptimo parto).

Efecto del toro

El efecto del toro sobre la duración de la gestación en búfalos no fue significativo en algunos estudios [51,65]. Sin embargo, estudios en búfalas Murrah [41] y Nili-Ravi [27] revelan efectos significativos del toro sobre la duración de la gestación de las búfalas. La interacción entre el toro y el sexo de la cría fue significativa (P<0.01), además de una diferencia significativa en la duración de la gestación de las crías de búfalo macho y hembra [41].

Fertilización y formación del embrión

Las características de la fertilización, el desarrollo del CL y el desarrollo embrionario temprano en búfalos se han descrito en un capítulo anterior de este libro (Capítulo 2) [96]. Brevemente, al aparearse, el búfalo deposita el semen en la vagina anterior [97]. En las búfalas, se han encontrado espermatozoides en los oviductos en un lapso de 2 a 4 minutos después de la deposición de semen en el cérvix [98], sin embargo, los espermatozoides deben ser capacitados antes de que sean capaces de fertilizar un óvulo. Los estudios in vitro han revelado que los espermatozoides de búfalo requieren 4-6 h de capacitación [99,100]. Un solo espermatozoide capacitado penetra en el ovocito y esto resulta en la liberación de calcio dentro del ovocito hasta la finalización de la fertilización y la formación de pronúcleos [101]. Después de la fertilización del ovocito, se completa la meiosis y el ciclo celular vuelve al patrón mitótico [102]. La división de ovocitos de búfalo fertilizados in vitro se observa en el Día 2-3 de la fertilización [103,104]. En el Día 4, el 20,9% y el 50% de los embriones estaban en el estadio de 6-8 células y de 16 células a mórula [103]. El embrión fertilizado desciende al útero alrededor del día 4-5 en la búfala [18,19]. Las células externas de la etapa de mórula se diferencian en un epitelio llamado trofoectodermo mientras que los blastómeros internos se posicionan en un polo del embrión formando la masa celular interna (ICM por sus siglas en inglés) [102]. Esto se conoce como compactación y el embrión organizado resultante se denomina blastocisto. Los picos de blastocisto se observaron en el Día 8 en búfalos [103]. Entonces el blastocisto acumula líquido y se expande eventualmente eclosiona de la zona pelúcida. Los picos de blastocistos expandidos y eclosionados se observaron en los Días 9 y 10, respectivamente, en condiciones de fertilización in vitro en el búfalo [103]. Alrededor del momento de eclosión, el ICM se diferencia en dos poblaciones celulares: las que están de cara a la cavidad del blastocisto se aplanan y se deslaminan formando una capa celular interna denominada hipoblasto; las células restantes forman las múltiples capas del epiblasto [102]. El hipoblasto y el trofoectodermo son linajes celulares extraembrionarios que participarán en la formación de membranas fetales, mientras que los derivados del epiblasto establecerán todos los linajes de células embrionarias [102]. El epiblasto forma tres capas germinales: ectodermo, mesodermo y endodermo [105] y un derivado prominente del endodermo es el intestino primitivo que le da el nombre a todo el proceso como gastrulación [105]. Además de las 3 capas germinales, la gastrulación también establece las células germinales primordiales. Las 3 capas del ectodermo, endodermo y mesodermo fueron identificadas a partir de células madre embrionarias derivadas de la masa celular interna de embriones de búfalo [106].

Establecimiento de la gestación

El establecimiento de la gestación en rumiantes involucra cuatro eventos coordinados: elongación del embrión, reconocimiento materno de la gestación, implantación embrionaria y placentación.

Elongación embrionaria

El establecimiento de la gestación en las especies rumiantes incluyendo al búfalo, se inicia cuando el embrión fertilizado entra al útero alrededor del día 4.5 (108 horas) después del estro [19] y se caracteriza por el reconocimiento de la gestación, implantación y placentación. Entre los Días 6.5 y 7.5, los embriones en etapa de blastocisto son predominantes en el útero bubalino [19]. El blastocisto tiene una masa celular interna, un blastocele y una monocapa externa de trofoectodermo. En el ganado bovino, el blastocisto eclosionado forma un concepto ovoide entre el Día 12 y el 14 que tiene solo unos 2 mm de longitud en el Día 13 [107,108]. Entonces el blastocisto bovino se alarga y se vuelve filamentoso. El concepto bovino en el Día 14 tiene cerca de 6 mm y alcanza una longitud de 60 mm en el Día 16 y mide 20 cm o más el Día 19 [107,108].

La elongación del concepto en el búfalo es poco conocida. Un estudio mostró la presencia del filamento de corion delgado y alargado en toda la longitud del cuerno uterino gestante, con un saco vitelino alargado entre los Días 10 a 15 de gestación [17]. En otro estudio sobre tractos reproductivos de búfalos derivados de matadero, el tamaño de los blastocistos fue de 112 x 108 mm en el Día 10 y de 328 x 170 mm en el Día 15, lo que sugiere un aumento triple de la longitud entre el Día 10 y el Día 15 [16]. La morfología embrionaria observada en las especies bufalinas gestantes entre los días 17-19 [17] fue similar a la observada en el ganado bovino. La elongación del concepto implica efectos coordinados de la progesterona ovárica, las prostaglandinas y el cortisol secretados por las células epiteliales del endometrio y el trofoectodermo del concepto en elongación [108]. Cuando se completa la elongación del trofoblasto en el Día 16-18, la unión entre el conceptus y el epitelio uterino comienza en el día 22 de gestación en la vaca [109]. En los rumiantes, la implantación no es invasiva (sinepiteliocorial) y se produce en un sitio predeterminado (carúnculas) en el endometrio [109]. Durante el período de elongación del concepto, aparecen células binucleadas intraepiteliales especializadas dentro del trofoectodermo y estas aumentan en número en las áreas del trofoectodermo adherido a las áreas carunculares del epitelio uterino [110].

Reconocimiento materno de la gestación

En las especies rumiantes, la presencia de un embrión viable en el lumen uterino debe indicar al útero su presencia para mantener en vida al cuerpo lúteo que producirá suficiente progesterona para permitir que la gestación continúe. En ausencia de estas señales, el endometrio secretaría prostaglandina alrededor del día 16-17 en bovinos y búfalos, lo que resultaría en la expulsión del embrión y la reanudación de la ciclicidad. En ausencia de estas señales, el endometrio secretaría prostaglandina alrededor del Día 16-17 en bovinos y búfalos, lo que resultaría en la expulsión del embrión y la reanudación de la ciclicidad. El interferón-tau (IFN-τ) es un interferón tipo-1 que se secreta a partir del ectodermo del embrión en elongación en estado de blastocisto durante de la peri-implantación. El IFN-τ ha sido implicado como la molécula principal involucrada en el reconocimiento materno de la gestación en bovinos [7] y búfalos [8]. El IFN-τ actúa sobre el endometrio para anular el mecanismo luteolítico del endometrio ya sea inhibiendo la transcripción de los receptores de estrógeno y / o de oxitocina [111,112]. Otro modo de acción probable del IFN-τ parece ser la modulación del patrón de síntesis de prostaglandinas al aumentar la producción de PGE2 luteotrófica en lugar de PGF2α [109]. El IFN-τ bubalino se identificó mediante un modelo de homología a partir de IFN-τ ovino [8]. El IFN-τ bubalino reveló 8 isoformas diferentes que se expresaron en las excrecencias del trofoectodermo durante la gestación temprana en la búfala [9].

IFN-τ también parece estar involucrado en el desarrollo de blastocistos. La adición Bu IFN-τ recombinante bubalino (2 μg / ml) mejoró significativamente la tasa de producción de blastocistos (45.5% contra 31.0% para los controles) en condiciones de cultivo in vitro [113]. El IFN-τ recombinante bovino estimuló la producción de PGE2 por las células del estroma endometrial de búfalo de una manera dependiente de la dosis [10]. Las células estromales endometriales bubalinas en cultivo in vitro revelaron un aumento de la síntesis de proteínas [11,12]. IFN-τ estimula la transcripción de una serie de genes y actividades de varias enzimas implicadas en la elongación e implantación del concepto [107,114]. El análisis global del perfil del transcriptoma del concepto bovino del día 16 y los tejidos endometriales revelaron 87 ligandos, 46 de los cuales eran específicos del concepto y 34 específicos del endometrio [115], lo que sugiere la importancia de las interacciones entre el concepto y el endometrio en el reconocimiento materno de la gestación. Los cambios en los proteomas del suero y los perfiles proteómicos del corioamnios embrionario y las carúnculas uterinas también se registraron durante la gestación temprana en los búfalos [14, 15]. Además del IFN-τ, la presencia del factor inhibidor de la leucemia (LIF), una citoquina de la familia de la interleucina-6, durante las diferentes etapas del desarrollo del embrión de búfalo desde los ovocitos hasta la etapa de blastocisto eclosionado, indicó que también juega un papel en el desarrollo del embrión bubalino [116].

Implantación

Los intercambios de señales recíprocas entre el concepto y el microambiente uterino mantienen una producción óptima de progesterona y un concepto elongado que parece ser esencial para la implantación. El epitelio luminal uterino se prepara para la fijación e implantación del trofoectodermo por alteraciones en la expresión del gen endometrial y actividades secretoras y funcionales [117]. Se encontraron diferencias significativas en los genes expresados durante la transición del blastocisto (Día 7) a un concepto ovoide (Día 13) en el ganado bovino, sin embargo, la expresión temporal del gen en el endometrio es similar en animales gestantes y cíclicos hasta el momento de reconocimiento materno de la gestación (Días 14-16) cuando los factores derivados del concepto afectan la expresión de una gran cantidad de genes en animales gestantes [118]. Se sabe que la expresión de una cascada de moléculas de señalización durante el reconocimiento materno del embarazo se ve afectada por genes como el interferón-τ, las proteínas reactivas cruzadas de ubiquitina, la grelina, la aldo-ceto reductasa IB 5 y la SERPINA 14 [118,119]. El gen de la grelina se identificó a partir del CL de búfala y se observó que las señales de la proteína de la grelina eran más altas durante la gestación temprana en las búfalas [120]. Los cambios en los perfiles de transcriptoma determinan la implantación de embriones en bovinos y en búfalas [121,122]. Los principales cambios en la receptividad uterina a la implantación ocurren entre los Días 7 y 13 en respuesta a la progesterona ovárica, independientemente de si un embrión está presente o no [123].

Un gran número de proteínas fueron reguladas al alza en embriones de búfalo en el Día 27, que se desarrollaron normalmente [14,50]. El análisis del líquido luminal uterino reflejó que existe una amplia variedad de proteínas de origen fetal y materno durante el período de preimplantación en el ganado [123]. Los fluidos luminales uterinos, conocidos colectivamente como histótrofos, gobiernan la elongación del concepto a través de los efectos sobre la proliferación y migración así como también la unión y adherencia al epitelio luminal endometrial [124-126]. Los histótrofos son derivados de la síntesis y secreción de sustancias por el epitelio luminal endometrial y el epitelio glandular, siendo una mezcla compleja pero poco definida de proteínas, lípidos, aminoácidos, azúcares, iones y exosomas [127-130].

En un estudio sobre vaquillas bovinas preñadas, el análisis del perfil del transcriptoma endometrial reveló 109 ARNm con una abundancia dos veces mayor y se sabe que 41 de estos son inducidos por interferones [131]. El análisis de suero semanal de búfalos preñadas (desde el día de la inseminación hasta el día 42) mediante electroforesis en gel bidimensional y ensayo densitométrico, reveló cambios significativos en los proteomas del suero con al menos 65 puntos de gel en 2-D que muestran regulación positiva, regulación negativa o apariencia específica durante la gestación temprana [15].

Después de la elongación del concepto, se inicia el establecimiento la receptividad uterina del concepto al endometrio materno [109]. La remodelación del tejido endometrial es necesaria para la formación de cotiledones placentarios y el desarrollo de angiogénesis en la carúncula uterina [109]. Hay una fusión de las células binucleadas coriónicas fetales con las del epitelio uterino que forman las células trinucleadas feto-maternas, la invasión parcial de las células del trofoblasto en el endometrio materno y la reorganización de los vasos sanguíneos [110].

Cuando ocurre la fijación, se establecen los contactos celulares entre las puntas de las microvellosidades uterinas y las membranas celulares trofoblásticas [109]. Las integrinas, que aparecen en la superficie celular del trofoblasto y el epitelio uterino, se unen a la matriz extracelular (ECM), seguidas de la producción de factores de remodelación de tejidos, metaloproteinasas de la matriz (MMP) [109]. Estas MMP degradan las ECM y ayudan al conceptus a penetrar el estroma uterino. Distintas gelatinasas y metaloproteinasas de matriz estaban presentes en el líquido luminal uterino en la gestación temprana de búfalas (43-65 días) [132].

La unión implica el bloqueo/regulación descendente de una glicoproteína transmembranal Mucina-1 (MUC-1) observada en rumiantes, incluyendo a los búfalos [133], que tiene propiedades anti-adhesivas. La fijación transitoria ocurre entre los días 16.18 de la gestación hasta el Día 25-30 en varios rumiantes. El embrión se une secuencialmente al epitelio uterino por interacciones de factores adhesivos [134]. El desarrollo de proyecciones parecidas a las vellosidades entre el conceptus y el epitelio caruncular uterino favorece la unión completa que permite la absorción de las secreciones glandulares endometriales de los histótrofos [6,135].

El factor de transcripción de dominio POU (Pou5f1 (Oct-4) está involucrado en la regulación transcripcional durante el desarrollo embrionario temprano y la diferenciación celular. La expresión de Oct-4 fue mayor en la masa celular interna de embriones de búfalo en comparación con el trofoectodermo [136]. Este patrón de expresión génica también depende de la calidad de los ovocitos [137]. El desarrollo e implantación embrionaria temprana se considera respaldado por los efectos autocrinos y paracrinos de la insulina, como lo demuestran los receptores de insulina dentro del embrión y las células oviductales [138]. Esto se demostró en experimentos clínicos en búfalos [139,140]. Las búfalas tratadas con insulina (0.2 IU/kg SC) en los Días 8-10 de apareamiento, tuvieron tasas de concepción más altas y progesterona plasmática más alta en comparación con los controles no tratados.

La implantación en el búfalo parece ser similar a la del ganado que tiene una implantación céntrica y no invasiva con una aposición y adhesión creciente de células epiteliales trofoectodermo-uterinas sin erosión permanente del epitelio uterino [6]. Dentro de las vellosidades coriónicas, en rumiantes incluyendo a las búfalas, es posible distinguir dos poblaciones celulares diferentes, que pueden identificarse durante la gestación: las células trofoblásticas mononucleadas (MTC) y las células gigantes trofoblásticas binucleadas (BNC). Estas poblaciones celulares tienen diferentes morfologías y funciones. Las MTC se localizan a nivel de la lámina basal y se caracterizan por la presencia de un núcleo de forma irregular con cromatina dispersa. El número de MTC en las búfalas es definitivamente más alto que el de las BNCs, ya que representan alrededor del 80% del número total de células del trofoectodermo. Sin embargo, estas muestran una forma cuboide a columnar y menores dimensiones en comparación con la BNCs. Las células binucleadas en la búfala migran hacia el epitelio materno y se fusionan con las células del epitelio uterino formando las células trinucleadas [141]. Sincitios más grandes, con más de tres núcleos, son mucho menos frecuentes que las células trinucleadas en las placentas de las búfalas [141]. Los procesos microvellosos que se originan a partir de las células del epitelio uterino materno en la carúncula forman las zonas de unión que se unen con áreas especializadas en el trofoectodermo [20]. Esto da inicio a la implantación y a la comunicación de célula a célula.

Placenta

Los mecanismos del desarrollo placentario son complejos. La formación placentaria comienza después de los Días 18 a 19 de gestación en el bovino, cuando el trofoectodermo se extiende y las células del trofoectodermo se establecen dentro del útero. Estas células juegan un papel clave en el crecimiento de la placenta, formando una relación íntima con las células somáticas embrionarias o el mesodermo para formar el corion, que luego se vuelve altamente vascularizado al fusionarse con el alantoides para formar el corioalantoides [142,143].

El continuo crecimiento y desarrollo de las carúnculas es el resultado de la proliferación celular y remodelación del tejido endometrial que aumenta la superficie del área de contacto para el intercambio de nutrientes y el anclaje mecánico para una implantación efectiva del embrión y el desarrollo placentario [144]. Se ha planteado la hipótesis de que la unión del embrión y la formación de placenta en las especies de búfalos comienzan más tarde que en el bovino, probablemente alrededor de 30-35 días [20]. Las placas placentarias se observaron por primera vez en la membrana corioalantoides que rodeaba al embrión bubalino en el día 30, pero la unión era incompleta hasta el Día 60 [145]. Las criptas primarias se observaron en la carúncula materna de la búfala en el Día 42 de gestación, lo cual dio lugar al crecimiento de ramas secundarias desde el Día 53 con la aposición feto-materna progresiva y firme con una vellosidad terciaria observada en el Día 87 de gestación [146].

La placenta bufalina es epiteliocorial y policotiledonaria [147]. El número total de placentomas aumenta desde la gestación temprana hasta la mitad de la gestación con una tendencia a disminuir hacia el final de la gestación [148]. El número de cotiledones en los cuernos gestantes y no gestantes fue de 58,89 y 39,65 respectivamente [149].

Los placentomas en el útero grávido de la búfala se organizan en cuatro hileras con un máximo de 102 en el cuerno grávido y 96 en el cuerno no grávido [150]. El tamaño máximo de los placentomas en el cuerno uterino grávido hasta los 210 días de gestación fue de 10,0x4,6 cm y en el cuerno no grávido fue de 6,6x3,5 cm [150]. El número de placentomas en las búfalas varió de 58 a 106 y aumentó entre los Días 55 a 95 de gestación [151]. El peso medio de la placenta en búfalas Surti fue de 2,89±0,10 kg (rango de 1,5 – 5,0 kg) y el número medio de cotiledones fue de 76±2,40 (rango de 38 a 105) [152].

El peso y el volumen de los cotiledones, el peso del feto, los líquidos fetales y el cordón umbilical estuvieron fuertemente afectados por la edad gestacional [153]. El placentoma de búfala tiene una ramificación de vellosidades ligeramente cónica simple, que parece ser más pequeña que en el ganado, lo que indica una interdigitación feto-materna diferente y menos compleja en las búfalas [154]. La arquitectura microvascular de los cotiledones fetales en la búfala estudiada desde el 3er hasta el 10mo mes de gestación, reveló que la vasculatura fetal de los placentomas en la búfala aumentó mucho desde la gestación temprana hasta casi al término, al igual que el volumen y la densidad del sistema capilar de las vellosidades terminales [155].

El cordón umbilical en los búfalos tenía 11,8 cm y está formado por 2 arterias gruesas y 2 venas delgadas [156,157]. El diámetro y grosor de la arteria umbilical fue mayor que el de las venas hasta el Día 95 de gestación pero posteriormente no hubo diferencias de tamaños [156]. El flujo de la sangre en las arterias uterinas medias fue evaluado mediante ecografía Doppler a color y reveló un incremento secuencial en el diámetro de ambas arterias uterinas a medida que progresaba la gestación, con un aumento significativo en el volumen y la velocidad del flujo sanguíneo durante el último trimestre de gestación [158]. El uraco, una estructura tubular que conecta la vejiga urinaria con la cavidad alantoica utilizada por el feto temprano para pasar la orina directamente a la cavidad alantoidea durante la primera mitad de la gestación, desaparece después del nacimiento, debido al colapso de las arterias umbilicales. La persistencia de esta estructura después del nacimiento es rara en el búfalo [159,160].

Durante los dos primeros tercios de la gestación, la tasa de crecimiento de la placenta excede la del feto. Durante el último tercio de la gestación, la situación se revierte probablemente debido a las mayores demandas nutricionales del feto en rápido crecimiento [97].

Fluidos fetales y membranas fetales

En los búfalos se ven tres membranas fetales: el corion, el saco alantoideo y el amnios [161]. El saco vitelino es una membrana opaca que desaparece durante la gestación [161]. Los cambios secuenciales en la progresión del crecimiento uterino y fetal, y el aumento de los fluidos fetales y las membranas fetales se han tabulado en un capítulo anterior [147] (Capítulo 8). El corion durante los primeros tres meses de gestación se presenta como una lámina sencilla de células circulares con núcleos esféricos denominados trofoblastos; hay otro tipo de células denominadas células trofoblásticas gigantes con 2 o más núcleos [161]. La alantoides durante el mismo período reveló muchos vasos llenos con eritrocitos y células alargadas que forman un epitelio simple estratificado. El amnios es avascular y transparente y consiste en epitelio simple estratificado [161]. El saco vitelino durante los primeros 3 meses de gestación era opaco y no estaba en contacto con las otras membranas y desapareció durante la gestación [161].

Se encontraron placas amnióticas aplanadas suaves como gomas de forma irregular (tamaño máximo 2x2x1 cm a 8,5 x 5,5 x2 cm) hacia las puntas de un amnios transparente blanco en las búfalas parturientas, con el 66% de 106 búfalas revelando 1 o más hipómanes [162].

 Estos se observaron entre los Días 79-220 de gestación [150,163]. Las concentraciones medias de nitrógeno ureico, creatinina, proteínas y potasio fueron significativamente más altas en el líquido alantoideo, mientras que el nivel de sodio fue significativamente más alto en el líquido amniótico durante la gestación con ligeras variaciones [164]. Los cambios secuenciales en las moléculas bioquímicas en los líquidos alantoideo y amniótico se registraron especialmente entre 55 y 165 días de gestación [164]. La evaluación del volumen, color, consistencia y pH de los líquidos alantoideo y amniótico durante las diferentes etapas de gestación en la búfala reveló que hasta 105 días y después de 166 días de gestación, la cantidad de líquido alantoideo era mayor que el líquido amniótico, mientras que entre los días 121-165 la cantidad de líquido amniótico excedió la cantidad de líquido alantoideo [165]. Desde la mitad de la gestación, el líquido alantoideo era mucoide y de color pajizo, mientras que el líquido amniótico era de color ámbar a amarillo y mucoide, y el pH de ambos líquidos era alcalino  entre los Días 50 a 150 de gestación [165]. Las concentraciones de la proteína total, urea y creatinina aumentaron en el líquido amniótico mientras el pH, la densidad y el calcio oscilaron con el avance de la gestación. En el líquido alantoideo, la densidad, la albúmina y la creatinina aumentaron, mientras que el pH y el calcio disminuyeron [166,167].

Funciones de la placenta

La placenta realiza las funciones de intercambio de nutrientes, gases y productos de desecho entre la madre y el feto. Además de esto, la placenta secreta y sintetiza algunas proteínas, hormonas y otras moléculas. Las complejas interacciones entre la madre y el feto resultan en la remodelación de las estructuras placentarias, el suministro de sangre y la función secretora durante toda la gestación.

Proteínas placentarias

La placenta produce una variedad de proteínas con características distintas. Las proteínas de la familia de la prolactina placentaria bovina (PRL) incluye el lactógeno placentario bovino (PL) que participa en el reparto de los nutrientes para mantener el desarrollo fetal, mientras otras proteínas de la familia PRL poseen propiedades angiogénicas [168]. Otras proteínas importantes, como las glucoproteínas asociada a la gestación, son una mezcla de proteínas similares a la proteinasa aspártica placentaria. Una gran cantidad de proteínas, algunas de ellas mostrando inmunorreacciones, fueron extraídas de los extractos placentarios de la búfala [13]. Las proteínas identificadas incluyen la proteína B específica de la gestación [169] y las proteínas asociadas a la gestación [170].

En un estudio en búfalas iraquíes gestantes, se descubrió que los niveles de proteína B específica de la gestación eran más altos en el suero fetal (6 y 8 meses) que en los líquidos amnióticos y alantoideos, mientras que las concentraciones de progesterona eran más altas en los líquidos alantoideos desde el 6to al 8vo mes de gestación [169].

Las glicoproteínas asociadas a la gestación (PAG) son una familia diversa de glicoproteínas que se expresan de forma variable en diferentes etapas de la gestación. La placenta de rumiantes sintetiza glicoproteínas asociadas con la gestación durante la gestación. Se identificaron dos PAGS (PAG-7 y PAG-11) a partir de la placenta bufalina.

Se detectaron proteínas con pesos moleculares de 38, 56, 67, 75 y 85 kDa en extractos de placenta de búfala durante la mitad y el final de la gestación [13,170,172-173]. Así mismo el gene PAG-1 estuvo presente durante toda la gestación en la búfala [174]. Las concentraciones plasmáticas de PAG en búfalas aumentaron desde el día 28 (4,48 + 0,92 ng/ml) hasta el Día 41 (27,27 + 6,74 ng/ml) y se mantuvieron altas (20,71 + 9,20 ng/ml) hasta el Día 103 en búfalas gestantes que también tuvieron significativamente más progesterona plasmática (3,51-4,80 ng/ml) [175]. Las concentraciones de PAG fueron determinadas a partir de plasma fetal y materno, líquidos alantoide y amniótico obtenidos de búfalas de pantano procedentes de matadero. En los líquidos alantoideo y amniótico, las concentraciones fueron de 12,7+2,1 ng/ml y 24.0+7,3 ng/ml respectivamente. Las concentraciones plasmáticas de PAG en la madre y en el feto variaron de 15,5+1,4 ng/ml a 21,9+2,2 ng/ml para la madre y 16,1+1,8 ng/ml to 21,9+3,2 ng/ml para el feto utilizando 3 procedimientos de radioinmunoensayo diferentes [176]. Las PAG fueron detectables a las 6 semanas (3,9 + 1,3 ng/ml) y la concentración aumentó gradualmente hasta la semana 28 (39,6 + 4,0 ng/ml) [177]. Se estableció una correlación lineal entre las concentraciones de PAG en plasma y el momento de la gestación [178]. Las concentraciones postparto disminuyeron alcanzando niveles muy bajos (<1.0 ng/ml) a las 5 a 8 semanas postparto [177,179]. Las PAG se sintetizan mediante células trofoblásticas mono y binucleadas [180]. Se identificó inmunorreactividad en gránulos en células placentarias binucleadas (BNC) de búfala [181]. La presencia de PAGs en el suero de las búfalas [182] ha sugerido que esta molécula es un biomarcador potencial para la detección temprana de gestación en la búfala [183] y ha llevado al desarrollo de antisueros [184] específicos para la detección de la gestación por radioinmunoensayo [185] con alta precisión (90-100%) entre el Día 19 y 55 [186,187]. Más recientemente se ha desarrollado y validado un kit ELISA para la detección de PAG en búfalas, para el diagnosticar gestación [188].

Se cree que las PAGs regulan la producción de progesterona al inducir la síntesis de prostaglandina E en las células lúteas y proteínas en el endometrio, apoyando así la gestación [189,190]. La molécula de trofoectodermo IFN-τ se considera la molécula principal que regula estas funciones durante las primeras etapas de la gestación [6]. Se ha planteado la hipótesis de que PAG probablemente asume las funciones de IFN-τ durante las últimas etapas de la gestación [20].

La presencia de productos de las células binucleadas en la circulación materna ha sido igualmente correlacionada con la placentogenésis y la remodelación placentaria [191]. El corioamnios y las carúnculas recolectados de búfalos gestantes con embriones en desarrollo normal o retardado tenían diferentes perfiles proteómicos que estaban asociados con la protección antioxidante, la inhibición de la proteasa y el plegamiento de las proteínas [14].

Transferencia placentaria

La placenta es un órgano temporal materno-fetal, cuya función principal es permitir el intercambio controlado de metabolitos entre madre y embrión/feto durante la gestación [192]. Además de la secreción de varias proteínas, el intercambio de nutrientes a través de la placenta es importante. La placenta media el transporte de nutrientes, gases y productos de desecho de su metabolismo entre la circulación materna y fetal [193]. Esto implica interacciones complejas entre las células placentarias, su remodelación, secreción y las células trofoblásticas fetales y los histótrofos secretados por el endometrio uterino [194]. Durante la gestación, el transporte de nutrientes de la madre al feto depende predominantemente del flujo sanguíneo uterino y de muchos otros factores interrelacionados [194]. El sustrato primario para el crecimiento fetal parece ser la glucosa, que se transfiere a través de portadores y posiblemente mediante la conversión a fructosa por la placenta [195]. Se revisó el transporte y la utilización de muchos sustratos necesarios para el crecimiento fetal, como lactato, ácidos grasos, cuerpos cetónicos, triglicéridos y aminoácidos [195], y estos autores concluyeron que en los rumiantes, se satisfacen los requisitos de energía del feto por oxidación de glucosa, lactato y aminoácidos, y en menor medida por acetato. Las concentraciones de calcio en la sangre fetal están reguladas principalmente por la hormona paratiroidea fetal y las concentraciones plasmáticas de vitamina D3 [196]. La transferencia de hierro en especies rumiantes es compleja debido a la falta de contacto directo de la sangre materna y fetal. Se supone que el hierro se transfiere al feto a través de la eritrofagocitosis trofoblástica en el área hematófaga de la placenta y también en las glándulas endometriales [197]. Las regiones glandulares intercarunculares en bovinos y búfalas gestantes son sitios importantes de secreción y transferencia de sustancias de la madre al feto [198]. Las áreas hematófagas en los placentomas y el área en la interfaz entre el corion y las glándulas endometriales son sitios importantes para la transferencia de hierro de la madre a los tejidos fetoplacentarios durante la gestación en las búfalas [199,200]. La migración de células gigantes fue evidente por primera vez a los 105 días de gestación con la migración máxima a los 143 días de gestación en las búfalas [201]. Se registraron numerosos hematomas placentarios distribuidos irregularmente en búfalas gestantes de 7-10 meses, a lo largo de la interfase feto-materna y estos contenían una cantidad variable de sangre materna infiltrada [202].

Cambios en los órganos reproductivos

Cambios en la morfología y la función uterina

Los cambios secuenciales en las dimensiones del feo y del útero durante la gestación en la búfala han sido resumidos previamente [147]. El peso del útero grávido y no grávido más allá del Día 60 de gestación fue de 815+60,48 g incrementando a 16433,33+151,19 g e entre los Días 166 a 210 de gestación [203]; el 50,33% de las gestaciones fueron en el cuerno uterino derecho [203]. Hallazgos similares se registraron previamente en búfalas egipcias [204]. Se registró un aumento significativo en la circunferencia de curvaturas mayores y menores y peso de cuernos grávidos durante la gestación temprana en búfalas Nili-Ravi [205]. El peso medio del feto a las 4 semanas fue de 0,68 g y la longitud del cuerno grávido fue de 25,25 cm, que aumentó a 241,12 g y 61,85 cm respectivamente a las 14 semanas de gestación [206]. El aumento de las dimensiones y el peso del útero debido al crecimiento del feto y los fluidos fetales, empuja el útero cranealmente y el útero desciende hacia la cavidad abdominal al cuarto mes de gestación [147]. El útero descendente alcanza el piso abdominal y luego crece cranealmente hacia el diafragma. A partir del séptimo mes, el crecimiento uterino es hacia arriba y las partes fetales están en la cavidad pélvica a partir de los 8 meses [147]. El patrón de crecimiento de los genitales femeninos en desarrollo con relación al crecimiento fetal no mostró un patrón consistente [207]. Las descripciones sobre evaluaciones ecográficas en búfalas han mencionado que el grosor combinado del útero y la placenta (CTUP) aumentó de 2.5 mm a los 2 meses de gestación a 12 mm a término [208].

El diámetro de las glándulas endometriales aumentó de 53.0 μ durante la fase lútea temprana a 60.8 μ a los 100 días de gestación en las búfalas con un aumento secuencial en el número de glándulas endometriales [145]. El epitelio en el área intercaruncular del útero estaba formado por células columnares pseudoestratificadas, pero en el Día 55 de gestación, la parte caruncular del endometrio estaba desprovista de células columnares [209]. En la búfala, en el Día 77 de la gestación, se produjeron cambios marcados en la región subcaruncular y los vasos sanguíneos eran prominentes con una pared gruesa [209]. El epitelio de revestimiento de ambos cuernos uterinos presentó pocos gránulos de mucopolisacáridos solo durante el primer trimestre y al final de la gestación [210].

Los estudios histológicos vaginales en las búfalas durante las diferentes etapas de la gestación revelaron diferencias no significativas en el número de capas y tipos de células. El suministro vascular aumentó a medida que avanzó la gestación y durante los últimos meses de gestación, la submucosa fue más vascular y edematosa [211]. Las células epiteliales no cambiaron significativamente en el orificio externo del cuello uterino, sin embargo, el porcentaje de neutrófilos y monocitos aumentó significativamente a medida que avanzó la gestación [212].

Crecimiento fetal

El crecimiento fetal y el crecimiento asociado con las membranas y los fluidos fetales revelaron que el peso medio del feto a las 4 semanas de gestación fue de 0,68 g y aumentó a 241,12 g a las 14 semanas [206]. El peso medio del feto en el segundo mes fue de 5.64 g y aumentó a 7.15 kg a los siete meses de gestación [213]. El volumen de líquidos alantoideos y amnióticos aumentó de 9,93 ml y 0,70 ml a las 4 semanas, a 328,0 ml y 8,92 ml a las 14 semanas de gestación en la búfala [206]. La longitud media del feto fue de 4.26-4.9 cm a los 60 días de gestación, aumentando a 83.4 cm a los 270 días de gestación [147]. El máximo crecimiento y desarrollo fetal se observó entre 240 y 305 días de gestación [207]. El desarrollo prenatal del feto en búfalos de pantano se ha descrito previamente y se observó una correlación lineal entre la edad gestacional del feto y el tamaño fetal [214].

Las descripciones ecográficas han sido más precisas para identificar las estructuras fetales y su crecimiento. El embrión y la vesícula amniótica fueron detectables en la cuarta y quinta semana de gestación [215]. La organización fetal y la osificación podrían identificarse a las 8 y 10 semanas de gestación. Los predictores de la edad gestacional sobre la base de los caracteres fetales revelaron altas correlaciones para la longitud de la grupa de la corona durante el inicio (8 semanas), el diámetro biparietal a la mitad (18 semanas) y el diámetro del globo ocular durante la gestación tardía (28 semanas en adelante) [215]. El feto adoptó la presentación anterior final en búfalas en la semana 30 de gestación [215].

Morfología y función ovárica

Se observó un ligero aumento en el peso de los ovarios desde el Día 60 al 210 de gestación en búfalas [203]. El cuerpo lúteo (CL) apareció de color marrón durante 30 a 150 días de gestación. El tamaño y el peso del CL aumentaron hasta los 4 meses de gestación y luego permanecieron sin cambios hasta los 150 días de gestación [216]. Los cambios morfológicos ováricos en los búfalos, incluidas las dimensiones y el peso de los ovarios y el CL, evaluados a partir de muestras de matadero [205,217], y mediante ultrasonografía transrectal [218], revelaron un aumento en el diámetro y peso del ovario ipsilateral al cuerno grávido hasta el 4to mes de gestación [218]. El aumento se mantuvo hasta el 6to mes de gestación [217]. Se observó un aumento secuencial en las dimensiones del CL y su peso, de 1 a 4 meses [218], y hasta 6 meses [205,217] de gestación en búfalas (Tabla 2). Los ovarios se empujaron hacia el borde pélvico a medida que el útero en crecimiento descendía hacia la cavidad pélvica alrededor de los 3.5-5 meses de gestación [147].

Los estudios ecográficos han revelado que el crecimiento folicular en los ovarios continúa durante la gestación temprana en la búfala [219,220]. No se observó influencia de la gestación en el número de olas o el momento del inicio de una nueva ola [220]. Sin embargo, durante los días 30, 40, 50 y 60, la población folicular en el ovario se redujo [221] y las olas foliculares se volvieron inconsistentes con patrones variables [219]. No hubo diferencias significativas en el diámetro de los folículos pequeños y medianos en diferentes días de gestación (20, 30, 40, 50 y 60), sin embargo, hubo una disminución significativa en el número de folículos grandes con el avance de la gestación [221]. Estos estudios sugieren que aunque los folículos continúan creciendo durante la gestación en las búfalas, los altos niveles de progesterona probablemente suprimen el crecimiento hasta el tamaño ovulatorio de los folículos y también suprimen el estro durante la gestación.

Sin embargo, pequeñas proporciones (1-13%) de búfalas muestran estro gestacional [222,223], probablemente debido a la baja progesterona lútea o una interrupción de los mecanismos que impiden el crecimiento del folículo a la etapa ovulatoria. Sin embargo, la gestación continúa normalmente hasta que la madre se acopla accidentalmente o es inseminada.

Cambios de peso corporal de la madre

A medida que avanza la gestación hay cambios en el cuerpo de la madre gestante. Estos cambios incluyen el peso corporal, y en las etapas terminales de la gestación, hay cambios importantes en la glándula mamaria. En las vacas lecheras, del 75% al 85% del aumento de peso ocurrió durante los últimos cuatro meses de gestación.  El aumento de peso de mes a mes fue muy uniforme en las novillas de primer parto en comparación con vacas más viejas [224].
En las búfalas Murrah, no hubo diferencias significativas en el aumento de peso corporal durante los primeros tres meses de gestación, sin embargo, desde el tercer mes en adelante, el peso corporal mostró un aumento más o menos uniforme hasta el parto [41]. El aumento de peso de las novillas Murrah fue de 27,15 kg, mientras que las búfalas adultas aumentaron 18,62 kg y las búfalas mestizas aumentaron 21,03 kg. Para las búfalas de pantano, cada dos meses de gestación contando desde el inicio, el incremento de peso corporal fue de 6, 14, 43, 24 y 13 por ciento del total del incremento (54,52 kg) respectivamente [225]. El peso corporal de las búfalas Murrah al parto varió de 491,70 kg del primer parto, a 607,5 kg al sexto parto [226]. Los animales que eran más pesados al parir, perdieron más peso corporal durante los primeros seis meses de lactancia. El promedio del peso corporal de búfalas de pantano gestantes aumentó de 444,5 kg a 477,6 kg desde aproximadamente 5 meses antes del parto hasta el parto [227]. Las búfalas lactantes perdieron peso corporal (12,2 kg) durante los primeros 4 meses después del parto [227]. Las búfalas Murrah que parieron en el invierno fueron más pesadas 2 semanas antes del parto, en comparación con las búfalas que parieron en el verano. Sin embargo, desde el parto a las 9 semanas posparto, tanto las búfalas que parieron en invierno como las que parieron en verano perdieron peso se manera similar (15%) [228].

Endocrinología de la gestación

Progesterona plasmática

Los estudios en búfalas han demostrado que un día después de la inseminación o el servicio, la progesterona en plasma comienza a aumentar y alcanza su nivel máximo en el día 13, tanto en las búfalas de río como de pantano [229-231]. En el Día 17, la progesterona se eleva a un pico de 3,47 ng/ml en las búfalas que quedaron gestantes [232,233]. Los niveles de progesterona continúan elevados en las búfalas gestantes [232]. En búfalas, la progesterona plasmática se mantiene elevada durante toda la gestación [230,231,234]. Durante los primeros 2 meses de gestación, las concentraciones plasmáticas de progesterona fluctuaron entre 1,9 y 3,8 ng/ml, disminuyendo ligeramente a 2,9 ± 0,8 ng/ml durante el tercer mes [235] y se mantuvieron niveles constantes con pequeñas variaciones hasta aproximadamente 8 días antes del parto [235] o a los 271-273 días de gestación [236]. De manera similar, en las búfalas de pantano, los niveles de progesterona en plasma se mantuvieron constantes durante toda la gestación (promedio de 1-5 ng/ml) [237-239]. Las concentraciones plasmáticas de progesterona disminuyen lentamente de 12 a 20 días antes del parto [240-242] seguidas de una disminución abrupta de los niveles basales al momento del parto [243,244]. Los niveles de progesterona en la leche (8,5 ± 0,8 ng/ml) en búfalas gestantes fueron casi 4 veces más altos que los niveles en suero en el Día 27 de la gestación [245,246]. La progesterona en el tejido placentario fue insignificante durante la gestación temprana en la búfala con ligeros aumentos entre los Días 97 y 250 [247]. Se han observado receptores de progesterona en las células binucleadas del trofoblasto de la placenta de búfalo [181]. La disminución preparto de la progesterona comienza desde los Días 276-278 [248]. Se ha observado una rápida disminución de la progesterona plasmática 3 días antes del parto [249].

Estradiol plasmático

En las búfalas, el nivel de estradiol17β disminuye un día después de la inseminación hasta el día 20 [250] y fluctúa dentro de límites estrechos durante el primer trimestre de gestación [248]. Se registraron ligeros aumentos en la concentración plasmática media de estradiol 17β (14,8 + 2,1 ng/ml) durante los primeros 4 meses de gestación disminuyendo a valores basales (<12 pg/ml) durante los meses restantes de gestación [235]. Durante el segundo trimestre, aunque se mantiene una concentración media general constante, es significativamente mayor en comparación con los niveles durante el primer trimestre [248]. Se registró un aumento en el sulfato de estrona en plasma en la circulación periférica materna de aproximadamente 5-6 meses de gestación en búfalas de pantano [239] y de río [235,252]. Se encontraron altos niveles de estradiol (108,2±9,1 ng/ml) en leche de búfalas gestantes durante el tercer trimestre de gestación [253]. Los niveles de estradiol comienzan a aumentar en el Día 241-243 de gestación para alcanzar los niveles más altos al parto [234,235,248].

Corticosteroides plasmáticos

Las concentraciones plasmáticas de corticosteroides permanecen constantes (1,7+0,3 pg/ml) durante la gestación [235]. Se notó un incremento significativo (5,3+1,8 ng/ml) en el Día 12 preparto en búfalas de rio y en el Día 15-20 preparto en búfalas de pantano [251] con picos a las 60 h, 36 h, 12 h y 0 h (16,8+3,2 ng/ml) preparto [235].

Gonadotropinas plasmáticas y receptividad pituitaria a la GnRH

Parece haber pocos cambios en la LH plasmática durante la gestación en búfalas de pantano (promedio 1-5 ng/ml) [251]. En búfalas de rio, los niveles plasmáticos de LH a los 2, 5 y 8 meses de gestación fueron de 2,01±0,11, 2,24±0,18 y 2,48±0,13 ng/ml respectivamente y no fueron significativamente diferentes entre sí [254]. Los niveles de FSH a los 2 meses de gestación (15,66±1,09 ng/ml) fueron significativamente más altos en comparación con los valores a los 8 meses (13,62±0,17 ng/ml) lo que sugiere una disminución en las concentraciones de FSH [254]. La capacidad de respuesta hipofisaria a la GnRH exógena reveló una disminución progresiva durante el avance de la gestación en las búfalas, lo que refleja el efecto de una retroalimentación negativa del aumento de la progesterona plasmática durante el avance de la gestación en las búfalas [254].

Metabolitos de prostaglandina

El metabolito de la prostaglandina plasmática periférica (PGFM) no aumenta alrededor del Día 18-20 del servicio si la búfala está gestante [255]. Las concentraciones plasmáticas de PGFH oscilaron entre 200-600 pg/ml durante los primeros 9 meses de gestación y aumentaron posteriormente (700-1000 pg/ml) 10 días antes del parto [234,235]. Se observó un aumento significativo en las concentraciones de PGFM en el día 9 antes del parto (2,2 + 0,2 ng/ml), a las 54 h (4,9 + 0,4 ng/ml) y a las 6 h (9,6 + 1,2 ng/ml) antes del parto [235].

Hormonas tiroideas

Según los estudios sobre los niveles de tirosina en plasma periférico durante la gestación avanzada en bovinos y búfalas, se supuso que el requerimiento de T4 del ternero fetal bufalino puede ser menor que el del ternero fetal bovino, ya que la gestación en la búfala es más larga y la tasa metabólica más lenta comparado con el bovino [256]. En las búfalas preñadas, los niveles plasmáticos periféricos de T4 fluctúan ligeramente a través de la gestación con un incremento menor a los 8-9 meses [257], mientras que en las vacas, la T4 plasmática aumentó bruscamente durante el primer trimestre alcanzando un pico al tercer o cuarto mes de gestación, seguido de una disminución gradual hasta el último mes de gestación [256,258,259]. En un estudio en búfalas Murrah gestantes, el promedio de los niveles de T4 y T3 fueron de 44,1±1,36 y 0,46±0,07 nmol/l lo cual fue significativamente más alto que los niveles de las búfalas no gestantes [260]. Los niveles máximos de T4 y T3 se observaron en la cuarta y octava semana de gestación [260]. Se ha observado un aumento estacional en los niveles plasmáticos de tiroxina (durante la temporada de lluvias) en las búfalas [261]. Las concentraciones medias de yodo unido a proteínas (5,97 μg / 100 ml) en búfalos Surti fueron considerablemente más altas durante la gestación temprana y comenzaron a disminuir después del Día 50 de gestación [262]. La suplementación de yodo durante la gestación tardía (0,3 a 0,5 mg yodo por kg de ingesta de materia seca) mejoró la T3 y T4 en las búfalas suplementadas y condujo a una disminución posterior significativa en los intervalos de parto y días abiertos después del parto [263].

Bioquímicos y electrolitos

Las proteínas séricas aumentan con la etapa de gestación (en general 8,78 g/dl en animales gestantes) hasta el Día 275 en búfalas y luego disminuyó significativamente con una fuerte disminución 6h antes del parto [264]. Se produjo un aumento considerable de la albúmina plasmática en los Días 268-271 de gestación en búfalas [265]. En las búfalas gestantes, el requerimiento de proteína es 12% de proteína cruda (PC) durante los primeros 240-270 días de gestación, mientras que se requiere 14% de PC a los 270-308 días de gestación [266].

Los valores medios de glucosa en sangre evidenciaron una ligera disminución con el aumento de los días de gestación en las búfalas [267]. Los niveles de glucosa en sangre fueron significativamente más bajos y el colesterol disminuyó ligeramente en el día del parto [268] en comparación con los valores de un mes antes del parto. El requerimiento de energía para las búfalas gestantes fue de 55.4% de nutrientes digestibles totales (TDN) (2.0 Mcal/kg ME) en materia seca entre 240 y 270 días de gestación, mientras que TDN fue de 60.6% (2.19 Mcal/kg ME) entre 270 y 308 días de gestación [266] lo que refleja las crecientes demandas del feto en crecimiento durante los últimos 2 meses de gestación [269].

Los niveles de electrolitos variaron ampliamente entre las búfalas gestantes y se registró una disminución significativa después de 6 meses de gestación en el calcio (Ca) y el fósforo (P) en suero sin ningún trastorno clínico [270]. Sin embargo, estos valores no fueron consistentes ya que otro estudio registró cambios significativos en el Ca y P durante los últimos 3 meses de gestación en búfalos [271]. Durante el octavo y noveno mes de gestación en búfalas, se registraron concentraciones significativamente menores de Ca y P en suero en búfalas con prolapso preparto [272,273]. En el octavo y noveno mes de gestación, los requisitos de Ca y P son 40 g y 35 g respectivamente (relación Ca / P 1: 1) [269]. Los búfalos criados en áreas con suelos deficientes en P revelaron valores más bajos de P [274]. Tales deficiencias pueden resultar en hemoglobinuria pre-parto [275]. Los niveles de hierro disminuyeron significativamente en búfalas gestantes al noveno mes de gestación [272]. Las concentraciones séricas de sodio, potasio y cloruro permanecieron sin cambios durante la gestación en las búfalas, mientras que las concentraciones séricas de cobre aumentaron y las concentraciones de zinc disminuyen con el aumento de la edad gestacional debido a las demandas del feto [276]. Las búfalas gestantes multíparas tenían niveles de electrolitos en suero más bajos en comparación con las búfalas primíparas y las concentraciones disminuyeron significativamente durante el clima extremadamente cálido y frío [277]. Recientemente se han mencionado los valores de referencia para los diversos electrolitos y bioquímicos en búfalas gestantes de menos de 6 meses y más de 6 meses de gestación [270], sin embargo, el rango es demasiado amplio para ser aplicable prácticamente. Se ha registrado una leve anemia durante las etapas terminales de la gestación en las búfalas de río [265,278] y de pantano [279] con un recuento de eritrocitos total significativamente bajo [278].

Inmunología

Recientemente se ha mencionado que el concepto y otros mediadores endocrinos configuran activamente la respuesta inmune materna durante la gestación temprana para facilitar el crecimiento y el desarrollo de una placenta funcional [280].

Las proteínas tanto de la porción cotiledonaria como la no cotiledonaria de la placenta de la búfala presentan actividad inmunosupresora [281]. La placenta es un órgano endocrino activo que secreta numerosas proteínas y esteroides y algunos de los productos placentarios tienen acciones inmuno-moduladoras en la interfaz feto-materna para prevenir el rechazo del feto [282]. La placenta bubalina exhibe actividad inmunosupresora en condiciones in vitro [283]. Una proteína placentaria con un peso molecular de 65 kDa se ha asociado con efectos inmunosupresores en los búfalos [283]. El no rechazo del feto involucra a las células B y T. Se mostraron efectos inmunosupresores de la proteína placentaria de búfalo de 65 kDa (bPP65) sobre las células T [283] y B [282], lo que sugiere que la respuesta primaria de anticuerpos involucra ambos tipos de células. Los antígenos leucocitarios de clase I del complejo de histocompatibilidad mayor (MHC) no clásico se expresaron en la placenta de búfalas al final de la gestación [284]. La transferencia placentaria de inmunidad no se observa en rumiantes y otras especies domésticas en las que la inmunidad se transfiere a través del calostro al nacer [192].

Embriología (desarrollo prenatal de los órganos)

Los estudios sobre la evaluación de la organogénesis en el feto en desarrollo han utilizado material de matadero para evaluar la morfología y el aspecto histológico de las células y los órganos y su funcionalidad en las especies bufalinas. Un número limitado de estudios han evaluado el desarrollo de diferentes órganos y estructuras que se mencionan. Las dimensiones del feto han sido utilizadas en muchos estudios, a saber, la longitud de la curva de la corona a la grupa (CVRL) o la longitud de la corona a la grupa (CRL).

Corazón

El corazón es probablemente el primer órgano en formarse y en funcionar durante el desarrollo [285]. Una descripción ecográfica en búfalas menciona que el primer latido cardíaco aparece por primera vez a los 25-27 días de gestación [286,287]. Los estudios histomorfogénicos en fetos de búfalo de matadero revelaron que alrededor de los 32 días de gestación o una CVRL de 0,9 cm, el corazón no era septado y tubular, estaba claramente dividido en cámara auricular común dorsalmente, ventrículos primitivos ventralmente, un tracto primitivo de salida con la región bulbo cordis proximal mente y el saco aórtico dorsalmente a una CVRL de 1,2 cm [288]. A una CVRL de 3,0 cm, se observaron el Septum primum, las almohadillas endocárdicas, el septum secundum y el foramen oval [288]. A un CVRL de 8,7 cm (66 días), se reconocieron el corazón interventricular y de cuatro cámaras junto con la válvula auriculoventricular, las cuerdas tendinosas y los músculos papilares [288]. Todas las estructuras internas del corazón estaban bien diferenciadas desde un CVRL de 50 cm en adelante [288].

Riñones

Los estudios histomorfologicos han revelado que el desarrollo de los riñones fetales en las búfalas se produjo en 3 etapas: es decir, pronefros, mesonefros y metanefros [289]. El pronefros fue observado a un CRL de 3 cm (42 días) el cual comienzo a degenerar a un CRL de 3,5 cm (45 días) y su degeneración fue completa a un CRL de 4,1 cm (47 días) [289]. El pronefros se localizaba a nivel del corazón, craneal al mesonefros sin glomérulos ni sistema de conductos [289]. El mesonefros comenzó a desarrollarse a un CRL de 4,1 cm (47 días) en la corteza del riñón [290]. La corteza y la médula podrían diferenciarse a un CRL de 5,7 cm (54 días) [289]. Se pudieron observar tres tipos de glomérulos, es decir el subcapsular, intermedio y yuxtamedular en los riñones del feto de búfalo a partir de un CRL de 10.3 (75 días) en adelante [290,291].
Los túbulos contorneados proximales y distales se observaron en la corteza del riñón a una CRL de 4,1 a 5,7 cm (54 días) [291]. Pudieron observarse tres tipos de glomérulos, es decir el subescapular, intermedio y yuxtamedular en el riñón de los fetos de búfalo desde un CRL de 10,3 cm (75 días) en adelante [291,292].

Pituitaria

El corte histológico de la cavidad hipofisaria de los fetos de búfalo reveló la bolsa de Rathke a 30 mm CVRL que se encuentra paralela al eje largo del feto [293]. La capa de células marginales que recubre la cavidad hipofisaria se observó por primera vez a 60 mm CRL y consistió en epitelio escamoso simple [293]. La neurohipófisis se diferenció a una CRL de 60 mm y el lumen desapareció a 80 mm [294]. La parte distal, la parte intermedia y la hendidura hipofisaria se observaron envolviendo la neurohipófisis a 120 mm CRL y en etapas posteriores [294]. Un estudio reciente sobre los corticotropos en la glándula pituitaria del feto de búfalo reveló que hubo un aumento significativo en la ACTH inmunoreactiva durante el segundo trimestre, mientras que las células de proopiomelanocortina inmunorreactivas aumentaron tarde durante el tercer trimestre [295].

Lengua

A 1,2 cm CVRL (34 días), la lengua estaba cubierta por una sola capa de células que se convirtió en 2 capas, una capa profunda de células cuboides y una lámina delgada de células superficiales a 2,5 cm CVRL (40 días) [305]. A 10,7 cm CVRL, la lámina epitelial se estratificó claramente y se dividió en zonas basales oscuras y superficiales claras [305,306]. A 21,4 cm CVRL (122 días), el epitelio escamoso estratificado se diferenciaba mejor en las superficies dorsal y ventral [305], con todas las capas de epitelio bien reconocidas a 29 cm CVRL (139 días). La primera evidencia de queratinización se observó en fetos mayores de 40 cm CVRL [305]. La primera indicación de la formación de papilas circunvaladas se observó a 10,7 cm CVRL (27 días) [305,307], y a 21,4 CVRL (122 días), las dos pilas de papilas se invaginaron profundamente el mesénquima de la lengua para formar los acinos serosos [308]. Las glándulas salivales submandibulares revelaron una actividad débil de fosfatos y oxidorreductasas a 11-19 cm CVRL (78-114 días) en las células acinares y el epitelio ductal que aumentó con el avance de la gestación. A 42-100 cm CVR (desde 168 días a término), se encontraron fosfatos alcalinos en el lumen de los acinos y a lo largo de los canalículos intercelulares [309].

Esófago

Hasta 7,5 cm CRL, la lámina epitelial tardía tenía 2 capas con una capa basal de células cuboides y una capa superficial de células columnares. Las células superficiales se volvieron poligonales y poliédricas a 11,2 cm CRL [296]. La lámina muscular mucosa tiene células mesenquimales de hasta 11,2 cm CRL que se diferenciaban en colágeno y fibras reticulares a una CRL de 14,7 cm, observándose el músculo esquelético a una CRL de 11,2 cm en el extremo craneal y a una CRL de 20 cm en el extremo caudal [296]. Se observó una correlación positiva entre el grosor de varias túnicas esofágicas y la posterior CRL (CRL de 22,4 a 62,0 cm) de los fetos en otro estudio [297].

Rumen

La lámina epitelial era estratificada cuboidal y divisible dentro de las zona basal oscura y superficial clara a una CVRL de 5,5 cm (53 días) [298,299]. Las papilas ruminales aparecen a una CVRL de 19,6 cm (120 días) mientras que los gránulos de queratohialina fueron observados en el epitelio a una CVRL de 38,5 cm (160 días) [299]. El colágeno y las fibras reticulares [299] estaban bien diferenciadas a un CVRL de 11,2 cm (79 días) [299]. Los mucopolisacáridos neutros aumentaron en los fetos a una CRL de 11,2 cm y se localizaron en las capas de células basales y medias del epitelio ruminal, sin embargo, a una CRL de 22,4 a 28,0 cm los mucopolisacáridos neutros mostraron una tendencia decreciente [300]. Desde una CRL de 14,7 a 20,0 cm, los mucopolisacáridos ácidos aumentaron, probablemente proporcionando fuerza al tejido conectivo y al epitelio [300].

Retículo

Las papillas de la lámina propia fueron inicialmente observadas a una CRL de 14,7 cm. La superficie de la mucosa mostró los compartimentos característicos del retículo a una CRL de 19,6 cm. Las papilas reticulares exhibían haces musculares y porciones apicales a una CRL de 60,1 cm y eran comparables a las de un adulto en esta etapa [301].

Duodeno

Los estudios histomorfologicos en fetos de búfalo mostraron que los pliegues de la mucosa se observaron a una CRL de 6 cm mientras que las vellosidades aparecieron a una CRL de 8,0 cm [302]. El mismo estudio informó que el epitelio se transformó de estratificado a columnar simple a una CRL de 19,5 cm y las células de enterocromafina se observaron a una CRL de 14,5 cm en vellosidades duodenales. Se sabe que las glándulas primordiales intestinales están presentes a una CVRL de 14,5 cm en fetos de búfalos Egipcios [303] y a una CRL de 22,5 cm en fetos de búfalos Murrah [302]. Las glándulas duodenales fueron observadas en la túnica submucosa a una CRL de 22,5 cm [302].

Intestino grueso

La proyección de la mucosa apareció en el intestino grueso de los fetos de búfalo durante la etapa temprana de desarrollo, mientras que las vellosidades se observaron por primera vez a una CVRL de 19,5 cm (119 días) en el recto [304]. La degeneración de las vellosidades comenzó a una CVRL de 39 cm (161 días) en el recto y las vellosidades desaparecieron a una CVRL de 88 cm (272 días) en todos los segmentos del intestino grueso [304]. Las células caliciformes aparecieron más temprano en el recto (CVRL 31,0 cm, 144 días) en comparación con el ciego y el colon (CVRL 39 cm, 161 días). Las glándulas intestinales estaban totalmente diferenciadas a una CVRL de 55 cm (198 días) y la lámina muscular mucosa apareció en todos los segmentos del intestino grueso a una CVRL de 60,2 cm (212 días) [304].

Hígado

La histogénesis del hígado en los fetos de búfalo reveló que el hígado en desarrollo a una CVRL de 1,5 cm a 4,0 cm, ocupaba una gran parte de la cavidad abdominal y estaba rodeado por una cápsula de tejido conectivo de una sola capa [310]. La lobulación hepática inicial y los componentes del área de la tríada portal fueron observados a  una CVRL de 26 cm [310,311]. La cápsula del hígado a una CVRL de 14,5 cm a 44,5 cm estaba hecha de colágeno y fibras reticulares [310,311]. La disposición típica de los hepatocitos que se asemeja al perfil histológico del hígado adulto se observó a una CVRL de 45,5 cm (176 días) [311]. En el hígado fetal a una CRL de 10 cm se observó una actividad de moderada a fuerte de histoenzimas en áreas dispersas que reflejan la funcionalidad [312].

Bazo

El bazo en un feto de búfalo de 51 días se observó en la cara dorsolateral del estómago y carecía de la típica cápsula esplénica [313]. El estroma esplénico a esta edad consistía en tejido mesenquimatoso. A los 74 días de gestación, la cápsula esplénica apareció como una capa fibrocelular delgada hecha de fibras de colágeno inmaduras con una capa delgada de fibras reticulares [313]. A los 90 días de gestación, se vieron las trabéculas saliendo de la cápsula. Se observaron cápsulas fibromusculares y trabéculas bien desarrolladas en un feto de 262 días [313]. El parénquima del bazo mostró desarrollo de arteriolas y linfoblastos periarteriolares en fetos de 90 días [313]. La actividad hematopoyética se observó claramente en la pulpa roja en fetos desde 166 días en adelante [313].

Timo

Alrededor de 23,2 cm CRL, el parénquima del timo no era divisible en la corteza y la médula [314]. Distintas trabéculas y septos no se encontraron en esta etapa [315]. A los 31,5 cm de CRL, algunos lóbulos del timo mostraron la formación de médula, mientras que en otros el parénquima estaba bien diferenciado en corteza y médula [314]. Se observó una zona medular bien desarrollada en la mayoría de los lóbulos que parecía más clara que la corteza a una CRL de 44,5 cm [314]. Hasta 44,5 cm de CRL, las fibras reticulares se limitaron a la zona periférica de la médula, mientras que se observaron en toda la zona medular durante las etapas posteriores [314]. La diferenciación de las fibras reticulares de los fibroblastos comenzó a 63 mm CRL (57 días) y fue distinta a 120 mm CRL (83 días) [316] en el timo de un feto de búfalo. A 367 mm CRL (156 días) una fina red de fibras rodeaba los principales vasos sanguíneos de los tabiques interlobulares. A una CRL de 7,5 cm (243 días), estas fibras forman una vaina de doble capa alrededor de los vasos sanguíneos de los tabiques interlobulares [316]. La presencia de fibras reticulares en los corpúsculos de Hassall del timo se observó a finales de la gestación en fetos de búfalo [316].
La histogénesis de los corpúsculos de Hassall comenzó a una CRL de 9,2 cm (70 días) en el búfalo y a una CRL de 13,5 cm (90 días) se observaron distintos corpúsculos de Hassal en la médula tímica fetal [317]. La degeneración de los corpúsculos de Hassall comenzó a los 6 meses de vida postnatal y desaparecieron por completo a los 2 años en los búfalos [317].

Glándula adrenal

Los estudios micrométricos en fetos de búfalos prenatales mostraron un crecimiento secuencial de la glándula adrenal entre 3,9 cm a 8,9 cm CRL [318]. La corteza adrenal y la médula se diferenciaron completamente hacia los  10,9 cm CRL, sin embargo, las células secretoras de adrenalina y noradrenalina se identificaron hacia los 21 cm a 32,5 cm CRL [319]. Las células corticales fetales (FC) se diferenciaron en los fetos de búfalo a una CRL de 10,9 cm [320]. La actividad inespecífica de las esterasas fue débil en la cápsula, el estroma y los capilares, de fuerte a intensa en la corteza fetal y débil a moderada en ambas zonas de la médula en los fetos de búfalo con un CRL de 10.0 cm a 89.0 cm [320]. La distribución de mucopolisacáridos neutros y mucopolisacáridos ácidos varió en diferentes regiones de las glándulas adrenales bubalinas prenatales (CRL de 3,9 cm a 89,0 cm) [321].

Glándula mamaria

La línea mamaria se observó por primera vez a 1,2 cm CRL (34 días), el montículo mamario a 1,7 cm (37 días) y los botones mamarios a 2,6 cm CRL (41 días) [322]. El cono epidérmico se encontró a 6,7 cm CRL (58 días) mientras que los conductos primario y secundario se observaron a 7,4 cm CRL (62 días) y 15 cm CRL (96 días) [322]. El primordium mamario apareció en la pared abdominal ventral, caudal al ombligo entre las extremidades posteriores entre 90-109 días y consistió en un brote primario localizado centralmente incrustado en tejido mesenquimatoso y cubierto externamente con epidermis [323]. A los 120-146 días de edad, el botón primario formó canales y dio lugar a botones secundarios. A los 152-182 días, la glándula mamaria mostró botones primarios y secundarios con canales [323]. La diferenciación de todas las capas de la piel junto con la cornificación se observó a 69 cm CRL (229 días) [322]. En los búfalos, los folículos pilosos, las glándulas sudoríparas, los músculos pilomotores y las glándulas sebáceas en la glándula mamaria, se desarrollaron a los 102, 139, 142 y 158 días de gestación, respectivamente [324].

Esqueleto óseo

Los indicios más tempranos del desarrollo craneal fueron reconocidos como una masa de mesénquima densa que envolvía el extremo craneal del notocordio en el Día 27 de gestación seguido por la formación de la placa basal a los 38 días. La formación del cartílago de Meckel se reconoció por primera vez a los 41 días [325]. La osificación del cráneo apareció por primera vez en los huesos de la mandíbula y del maxilar y en los molares a los 45 días [326,327]. El basioccipital, el exoccipital y la parte inferior del occipital escamoso fueron formados a partir de la placa basal [328]. La mayor parte del condrocráneo era cartilaginoso a los 45 días, y comenzó a osificarse a los 62 días en el basioccipital y exoccipital [326,329], y en el esfenoides y la ampolla timpánica [326]. La primera indicación de osificación en la mandíbula apareció en el Día 45 en las partes incisivas y molares y se extendió posteriormente a la rama [330]. La osificación en la parte coronoide se observó en el Día 61 y la osificación se completó en el Día 64 y el canal mandibular fue distinguible en el Día 70 [330].

La mayor parte del cráneo se osificó entre los Días 45 a 89 días de gestación en búfalos [326] y la osificación completa del occipital escamoso, basioccipital y exoccipital se observó a los 132 días [327,328]. El hueso esfenoides se desarrolló a partir de seis centros de osificación a los 62 días [329]. La osificación se reconoció primero en el orbitoesfenoide, el cuerpo del basiesfenoides y el aliesfenoides a los 62 días [329]. El último hueso del cráneo en osificarse fue el cornete dorsal a los 193 días [327].

La diferenciación de las vértebras cervicales, torácicas, sacras y coccígeas comenzó a una CVRL de 2.0 cm en fetos de búfalo [331]. Los discos intervertebrales fueron evidentes a 3.0 cm CVRL, siendo más anchos en la periferia y delgados en el centro [331]. La longitud de la región cervical disminuyó y la de la región lumbar aumentó con el avance de la edad fetal, mientras que la longitud de otras regiones se mantuvo sin cambios [331].

Ovarios

Las células germinales primordiales aparecieron en el mesenterio el Día 35 y en la cresta gonadal el Día 36 de gestación [332,333]. Los tejidos gonadales se diferenciaron en una corteza periférica y médula central en el Día 62 de gestación [334]. La formación de una gónada indiferente en forma de huso se registró en el aspecto ventromedial del mesonefros en el Día 47 [333]. Una sola capa de epitelio plano cubría la gónada indiferente en el Día 51 [333]. A los 67-83 días, los ovarios se ubicaron en el aspecto caudolateral de los riñones metanéfricos [335]. Alrededor del Día 85-87, los ovarios se separaron de los extremos nefríticos y migraron entre 94 y 174 días [336] a la posición pélvica que se completó a los 180-305 días [207,337]. La degeneración de las células germinales ováricas ocurre durante el 4º, 6º, 8º y 10º mes de gestación en los búfalos [337,338]. La mayoría de los ovarios fetales tienen forma ovoide durante el desarrollo y la longitud y el grosor máximo de los ovarios se notaron entre 158 y 305 días de gestación [339].

Oviductos

La primera evidencia de la formación de los oviductos se observó en los fetos de 41 días como una invaginación del epitelio celómico en el aspecto anterolateral del mesonefros, en la apertura del surco de Müller [340]. La estructura se volvió tubular a los 46 días de gestación y se localizó dentro del pliegue mesonéfrico. Los pliegues de la mucosa oviductal primaria, secundaria y terciaria aparecieron a los 94 días, 158 días y 191 días [340]. La mucosa, la capa muscular y la serosa se pudieron identificar a los 128 días y se parecían a las de un órgano adulto a los 191 días de gestación [340].

Útero

La primera evidencia de la formación del útero se observó en los fetos de 61 días a través de la fusión caudal de los dos conductos de Müller [341]. El epitelio del útero en desarrollo era de tipo columnar ciliado pseudoestratificado en fetos de 75 días [341]. Se observó una condensación progresiva y diferenciación de los tejidos mesenquimales y una cubierta serosa alrededor de la porción uterina en los fetos de 85 días [341]. El revestimiento uterino del epitelio se dobló a los 116 días de edad fetal y el endometrio, el miometrio y el perimetrio se distinguieron claramente en fetos de 130 días y se parecían a los de un útero adulto a los 174 días de gestación [341]. Las carúnculas endometriales aparecieron por primera vez a los 130-152 días [341,342] y las glándulas uterinas a los 191 a 280 días de edad fetal [341,342]. La longitud y el ancho medios máximos de los cuernos uterinos ocurrieron entre 158 y 305 días de gestación [339].

Cérvix y vagina

La primera evidencia de la formación del cuello uterino en los fetos de búfalo se observó a los 67 días de gestación, donde 2 tubos de Müller se fusionaron caudalmente para formar una estructura tubular común que se convirtió en el cuello uterino [343]. Los pliegues de la mucosa primaria aparecieron entre 85-121 días [342,343], los pliegues de la mucosa secundaria aparecieron entre 94 y 152 días [342,343] y los pliegues terciarios alrededor de los 130 días de gestación [343]. El epitelio del revestimiento cervical varió de pseudoestratificado a epitelio columnar simple [207].
La vagina se origina a partir del cérvix. A los 90 días, la unión cervico-vaginal estaba revestida por epitelio escamoso estratificado y una extensa masa celular en la luz representaba la parte del techo vaginal [344]. La longitud y el ancho máximos del cuello uterino, la vagina y el vestíbulo se produjeron entre 116 y 191, entre 158 y 191 y entre 240 y 305 días de vida fetal [339].

Testículos y epidídimos

Las gónadas indiferentes se observaron por primera vez en embriones de búfalo como una estructura nodular unida medial al mesonefros a los 43 días de gestación [345]. La formación de la túnica albugínea en la diferenciación de blastema en una estructura similar a un cordón testicular fue evidente a los 47 días de gestación [345]. Ambos testículos estaban unidos al aspecto lateroventral de los riñones y eran intraabdominales a la edad de 8 cm CVR (65 días) y comenzaron a migrar a la región inguinal a 18,2 cm CVR (110 días) con descenso completo al saco escrotal por 75 cm CVR (243 días) [346]. Las gónadas indiferentes finalmente se transformaron en testículos a los 300 días de gestación [345]. La diferenciación entre los conductos eferentes y el conducto epididimario se observó a los 74 días en fetos de búfalo macho [347]. El conducto epididimario estaba rodeado por 7-8 capas de células mesenquimales peritubulares que luego se transformaron en células musculares alrededor de los 110 días de gestación [347]. En este momento también se observaron células columnares ciliadas, no ciliadas y simples en el conducto epidídimo [347].

Gemelos y porcentaje sexual

La incidencia  de gemelos en búfalos es baja. Informes anteriores indicaron una incidencia de 0.01% a 0.2% [348,349]. La incidencia de partos gemelares en búfalas Indonesias y Malayas fue citada como aún más baja (0.0002%) [350]. El análisis de los datos de partos de las granjas organizadas con varias razas de búfalos, reveló que la incidencia varía de 0.057% a 0.63% (Tabla 3). La mayoría de los gemelos búfalo nacieron de madres multíparas, en su tercera o mayor gestación [351-353], lo que sugiere un aumento en la actividad ovárica más allá de la tercera gestación. Los informes también indicaron que la mayoría de los gemelos búfalos nacidos eran heterosexuales (1 macho y 1 hembra) [351,352,354], excepto en un informe que indicó el nacimiento de 2 pares de gemelos machos y 2 pares de gemelas además de 2 pares de gemelos heterosexuales [355], y un informe de un caso clínico que indicó el nacimiento de 2 gemelos machos [356]. La longitud de la gestación en las búfalas que paren gemelos puede ser más corta que en los partos simples [352] o normales [351,352], pero el peso al nacer de las crías gemelas puede ser menor que el parto de una sola cría [352]. Los gemelos pueden provocar la muerte fetal antes o durante el parto [352] y, a veces dificultades al parto [351,354,356]. No se mencionó en ningún informe si los gemelos del mismo sexo [355] eran idénticos y se originaron en un solo cigoto. Del mismo modo, solo un informe mencionó la evidencia de un freemartin (quimerismo cromosómico sexual) en una cría hembra gemela con una cría macho [352]. Tres informes mencionaron el nacimiento de trillizos en búfalos [357-359] y un informe mencionó el nacimiento de cuadrúpedos en búfalos [360]. Sin embargo, los quimerismos cromosómicos sexuales fueron mencionados solamente en dos informes [357,358]. Los freemartins fueron encontrados por evaluación citogenética en búfalos de rio italianos [361] que presentaron infertilidad; sin embargo, no se mencionó si el freemartin fue de parto heterosexual. Por lo tanto, parece que la incidencia de freemartin en los búfalos es baja [362]. Los prospectos de inducción de gemelos por transferencia de embriones producidos in vitro en búfalas [350,363] son limitados debido al bajo crecimiento fetal y la dificultad al parto. Se describió un gemelo siamés unido [364] y un gran número de gemelos búfalo unidos que resultaron en partos difíciles han sido revisados previamente [365].
También se registraron gemelos en búfalos de pantano en Tailandia que habían sido tratados para la sincronización del estro [366].

La proporción de sexos de los nacimientos de machos: hembras en el búfalo muestra un sesgo masculino (Tabla 4). La proporción de sexos de nacimientos masculinos varió de 49.76% a 50.8% en dos granjas de búfalos Murrah organizadas en un estudio [372] y fue 55.64% en otro estudio sobre búfalos Murrah [373]. En Brasil, los datos de 232 genitales derivados de mataderos de búfalas gestantes revelaron 47.0% de fetos masculinos [141], mientras que los datos de búfalas italianas revelaron 49.84% de machos [368]. La frecuencia más baja y más alta de nacimientos masculinos se registró durante la temporada de verano [372] y lluviosa [374] o posterior al monzón [375]. La segunda paridad resultó en una mayor proporción de nacimientos masculinos en algunos estudios [372,375], sin embargo, otros estudios revelaron diferencias no significativas en la proporción de nacimientos masculinos: femeninos durante diferentes paridades en búfalos [60,374]. La repetibilidad de la proporción de sexos fue baja (-0.038 a -0.064) [372,374] y las estimaciones de heredabilidad para nacimientos masculinos fueron bajas a medianas (0,124 ± 0,12 a 0,43 ± 0,19) para los dos rebaños de búfalos Murrah evaluados [372]. El efecto del padre sobre la proporción de nacimientos masculinos en búfalos fue marcado [60,372].