Dinámica folicular en búfalas

Los mecanismos involucrados en el crecimiento, desarrollo y ovulación/atresia de los folículos ováricos son complejos y parcialmente entendidos. Durante la foliculogénesis ocurre una marcada proliferación y diferenciación de los componentes de las células somáticas, la cual es regulada por las gonadotropinas [1], factores de crecimiento intraováricos [2], interacciones locales e influencias nutricionales [3]. La identificación del crecimiento folicular en secuencias continuas (después del nacimiento) ha dado como resultado la clasificación de los folículos en el ovario como folículos primordiales, folículos primarios, folículos preantrales y antrales [3-4]. La foliculogénesis implica el crecimiento continuo de un grupo de folículos primordiales en el ovario a través de una serie de patrones de crecimiento que son regulados de manera diferente dando como resultado ya sea su ovulación o su regresión/atresia. El período de tiempo para esta transformación de folículos primordiales en folículos antrales es aproximadamente 3 meses [3]. El número de folículos primordiales [5], preantrales [6] y folículos antrales [7-8] en el ovario de la búfala es menor en comparación con la vaca. Los mecanismos que regulan la activación y posterior crecimiento de los folículos primordiales todavía siguen siendo poco conocidos, aunque algunos estudios han descrito el papel de los factores de crecimiento [3,8,9].

Los estudios en matadero en búfalas revelaron que los folículos antrales de diferentes tamaños están presentes en los ovarios durante las diferentes etapas del ciclo estral [7,10-14], sin embargo, de manera similar a la vaca, el monitoreo ecográfico diario de los folículos antrales reveló que las etapas posteriores del desarrollo de folículos antrales se caracteriza por dos o tres olas de crecimiento folicular durante cada ciclo estral [15-17]. Las olas foliculares parecen ser fundamentales y se han observado en búfalas jóvenes de 5-9 meses de edad [18], novillas prepúberes [19], durante la gestación [20,21] y en búfalas anéstricas [22]. Cada ola de crecimiento folicular está precedida por un aumento transitorio de la secreción de FSH en la vaca [23] y cambios similares ocurren en las búfalas [18]. Con base en la relación temporal de las hormonas, los factores de crecimiento y otros factores intra-ováricos, se ha mencionado que el crecimiento de folículos antrales es dependiente de gonadotropinas y factores de crecimiento [3]. El crecimiento de los folículos antrales progresa con la selección de folículos antrales destinados a crecer hasta la dominación de un folículo y atresia de los demás. El folículo dominante de la última ola es el folículo ovulatorio [24,25] con la manifestación de estro sincrónico con la luteólisis. Sin embargo, el mecanismo preciso de la selección y dominancia aún no se ha aclarado por completo. Se han revisado los mecanismos de la atresia folicular en mamíferos. Se ha sugerido que en la búfala, hay una disminución de la proteína de la unión Gap cerca de los vasos sanguíneos, lo que resulta en la disminución de la proliferación celular [26]. Las herramientas empleadas para el estudio de los folículos antrales en las búfalas incluye la selección de las candidatas para la sincronización de estro [27,28], inducción de la ovulación [29,30], selección de la fase de iniciación del tratamiento superovulatorio [31], y aspiración folicular guiada por ultrasonido [8,32] o la selección de los folículos obtenidos de ovarios de matadero destinados a la fertilización in vitro [33,34].

Este capítulo describe el crecimiento folicular ovárico en la búfala con respecto al período prenatal, el crecimiento folicular antral preantral y durante la pubertad, el ciclo estral, el embarazo y en el período posparto.

1. Desarrollo fetal de ovarios y folículos

1.1.        Desarrollo ovárico

Los estudios iniciales en búfalas Egipcias gestantes revelaron que la diferenciación gonadal primaria ocurre cuando el feto tiene una longitud cráneo-caudal de 7 mm, la diferenciación sexual fue a los 20 mm y se observaron los primeros folículos primordiales a los 600 mm, continuando el desarrollo hasta el nacimiento [35]. Los estudios posteriores en búfala egipcias y Murrah demostraron que a la edad gestacional de 3 meses, los ovarios aparecen como engrosamientos simétricos de forma oval o ahusada justo craneal al extremo anterior de los conductos de Müller diferenciados y unidos a los bordes caudo-laterales de los riñones [36,37]. A los 100 días, el ovario izquierdo comenzó a descender hacia la posición pélvica mientras que el ovario derecho estaba unido al riñón [37]. La posición pélvica final de los ovarios se alcanzó hacia el final del 6to mes y el ovario derecho tuvo un descenso más lento que el izquierdo [36].

Los pesos ováricos en las diferentes etapas fetales incrementaron de 27.0 ± 4.3 mg a los 3 meses a 82.8 ± 36.2 mg a los 10 meses de gestación [36]. El aspecto macroscópico de los ovarios prenatales en búfalas Surti reveló diferentes formas: almendrados, ovoides elípticos, ovoides y en forma de frijol a partir de los 67 a 305 días de vida intrauterina [36,38]. Se han registrado descripciones similares en los ovarios de búfalas de pantano [39].

La cresta germinal apareció a los 36 días de gestación. El tejido gonadal se diferenció en una corteza periférica y médula central alrededor del día 62 [40]. A los 3 meses de edad, las gónadas se encontraban en una fase avanzada de diferenciación: la túnica albugínea estaba pobremente diferenciada pero las células germinales primitivas, las granulosas, las tecas y las células del estroma estaban presentes [36]. La médula reveló una apariencia casi adulta en el Día 158. El ovario estaba cubierto por epitelio superficial plano mezclado con células cuboidales durante los días 65 a 75 de gestación lo cual cambió a tipo columnar a los 158 días [40]. Las células germinales eran principalmente oogonias, muchas de las cuales estaban en mitosis y se observaron algunas en pignosis. Unos pocos oocitos estaban en meiosis temprana. Hacia el 4° mes, el epitelio germinal fue invadiendo la gónada para formar los cordones epiteliales y la rete testis era aparente. Las células germinales se encontraban aún en fase de oogonia y muchas estaban degenerando. Durante el 5° mes, el estroma ovárico y l túnica albugínea se volvieron más organizados y se observó a los cordones sexuales invadiendo el estroma. Fue aparente la actividad meiótica y el comienzo de la formación de los folículos primordiales que se observaron hasta el 6° mes de gestación [36]. El mayor número de células primordiales y germinales primarias se registró en los días 116-155 [40].

Durante el 7° y 8° mes de gestación, la túnica albugínea alcanzó su máximo grosor (200 micrones) y las células del epitelio germinal se volvieron aplanadas [36]. Hubo pocas oogonias, la mayoría de las células germinales eran oocitos. Varios de los oocitos estaban en degeneración. En los meses 9° y 10, se observó la actividad hormonal por la formación de folículos vesiculares los cuales se volvieron atrésicos. El ovario fue más claramente dividido en zonas cortical y medular y se encontraron células germinales sólo en la zona cortical [36]. El número de células/mm3 germinal del tejido ovárico se mantuvo bastante constante desde el quinto mes, excepto durante el noveno mes. El englobamiento de los oocitos por las células de la granulosa para formar al folículo primordial, coincidió con las primeras etapas de la profase meiótica. El número de células germinales por mm3 de tejido ovárico fue más alto en el 7° mes de gestación [35,36].

1.2. Oogénesis

Al momento de la diferenciación sexual, la gónada fetal femenina está constituida por oogonias y células somáticas del mesonefros. Las oogonias se desarrollan de las células germinales primitivas que han migrado dentro del ovario temprano en la embriogénesis [41]. Las oogonias fueron identificadas positivamente en el 3er y 4to mes de gestación. Hacia el 6to mes, su número había disminuido y muy pocas eran visibles [36]. Los oocitos aparecieron esporádicamente tan temprano como el 3er mes y aumentaron progresivamente hasta el nacimiento. Esquemáticamente, la oogénesis involucra tres fases: una fase proliferativa (0-3 meses; las oogonias se dividen activamente) [42], una fase meiótica (4-6 meses; se forman los oocitos primarios) [42,43] y una fase de degeneración intensa de las células germinales (7 meses hasta el final de la gestación) [36]. Hay 3 olas de degeneración de células germinales. La primera afecta a las oogonias y esta llegó al máximo en el 4° mes. La segunda y tercera ola afecta a los oocitos y ocurre en el 6° mes y al parto [36,44].

Los oocitos que no entran en degeneración, son detenidos en el estado de diploteno de la primera división meiótica y están rodeados por una capa simple de células de la granulosa, constituyendo estructuras denominadas folículos primordiales. La fase meiótica se presenta durante la vida prenatal en la mayoría de los mamíferos. En las búfalas de agua, la formación de los folículos primordiales se completa antes del nacimiento a los 127.84 ± 11.55 días, cuando la longitud cráneo-caudal es de 22.84 ± 4.74 cm [41].

Al final de la oogénesis, el ovario contiene a millones de folículos primordiales dentro de un marco de tejido intersticial y está recubierto por epitelio ovárico erróneamente llamado epitelio germinal [41]. Los oocitos formados durante el período fetal y neonatal son la única fuente disponible de oocitos durante toda la vida reproductiva. Tan pronto como la reserva de folículos primordiales es constituida, disminuye rápidamente por la atresia y desde el final del periodo de oogénesis, algunos folículos primordiales comienzan a crecer de forma continua, pero hasta la pubertad, la mayoría de estos desaparecen debido a la atresia [41]. Probablemente, sólo 1% de los ovocitos en total alcanzan la madurez y son liberados a través de la ovulación [43]. Una sección histológica de la corteza de una hembra reproductivamente activa revela que los folículos ováricos permanecen en un estado constante de crecimiento y maduración. La etapa de folículo primario es seguida por una proliferación de células de la granulosa que rodean el óvulo potencial dando lugar a un folículo secundario.

Más tarde en el desarrollo, se forma un antro por acumulación de líquido entre las células de la granulosa y separándolas. En esta etapa el folículo se clasifica como un folículo terciario, también conocido como folículo de Graaf [41].

Los ovarios de bufalas novillas pos-puberales tienen una reserva de tan solo 10.000 a 20.000 folículos primordiales [5] en comparación con los más de 100.000 en ganado. Los ovarios maduros son más pequeños que en ganado pesando alrededor de 2.5 g cuando están inactivos y 4 g cuando están activos, con un número menor de folículos terciarios que en ganado [5,45].

El cuerpo lúteo (CL) es más pequeño que en ganado. El CL con frecuencia no protruye marcadamente de la superficie del ovario y algunas veces carece de una corona definida. Estas características hacen que la identificación precisa de las estructuras ováricas por palpación transrectal en el búfalo sea más difícil que en el ganado [2,5]. La imagen ecográfica indica folículos maduros en un rango de tamaño entre 1.3 a 1.6 cm de diámetro y cuerpos lúteos maduros de 1.2 a 1.7 cm de diámetro [10,29,46]. En un estudio, la precisión para reconocer a folículos antrales llenos de líquido de menos de 4 mm utilizando ultrasonografía fue baja [47].

1.3. Perspectiva histórica

El primer informe sobre el estudio de las estructuras foliculares ováricas parece ser el de Memon y col., 1971 [10] quien registró que el los folículos antrales de diferentes tamaños están presentes en los ovarios durante los distintos estados del ciclo estral. Los informes iniciales sobre la apariencia ultrasonográfica y el crecimiento de folículos antrales en ovarios de búfalas parecen ser los de Taneja y col., (1996] sobre búfalas Murrah [15] y Baruselli y col., en búfalas brasileras [16] y estos investigadores registraron patrones de dos y tres olas de crecimiento folicular durante el ciclo estral. Muchos informes aparecen después sobre las dinámicas foliculares en búfalas Mediterráneas [24,48], Nili-Ravi [49], Mehsana [50], egipcia [30,31] y bufalas de pantano Thai [46]. El comportamiento del desarrollo folicular ha sido estudiado durante diferentes estados reproductivos en búfala terneras pre-púberes de [18,19]; durante el período posparto [51,52] y en búfalas novillas de durante la gestación temprana [20].

1.4. Población Folicular

El desarrollo folicular en búfalas no ha sido estudiado como en la vaca. Singh y col., [53] delinearon el patrón de desarrollo y atresia de folículos grandes (8 mm) en la superficie de los ovarios de novillas de búfalo. En el 65% de las novillas de pos-púberes, encontraron folículos de mayor tamaño en la mitad del ciclo concluyendo que estos hallazgos cumplen con la teoría de Rajakoski [54]. Los folículos a mitad del ciclo se vuelven atrésicos y comienza a crecer una nueva ola folicular a la mitad del ciclo dando lugar al folículo que será ovulado después del estro. La búfala se caracteriza por un reservorio reducido de folículos en comparación con la vaca; se ha informado que el número de folículos primordiales es de 12000 a 19000 en novillas de búfala rivereñas [55]. Además, por medio de evaluaciones histológicas, estudios del sistema folicular de novillas de búfala Surti cíclicas y no cíclicas, Danell [5] informó que se encontraron por par de ovarios, 12636 folículos primordiales en novillas de búfala cíclicas y 10132 folículos primordiales en animales no cíclicos, con un rango de 1222–40 327 folículos. Observó más atresia en los folículos de búfala (66.7%) que en folículos de bovino (50%) y detectó el mismo patrón en la dinámica folicular en búfalas que en vacas [54].

Se ha informado que el rango en el número total de folículos de superficie por ovario, en ovarios de búfala del matadero, en etapas aleatorias de reproducción, es de 5.14 a 6.06 [7,57].

Muchos estudios han examinado los folículos preantrales y primordiales en ovarios de búfala e informaron que se encontraron folículos en un número mucho menor en los ovarios de búfalas que en las vacas [7,8,43,58,59].

Figura 1. Fases del desarrollo folicular

1.5. Crecimiento folículo preantral

Los folículos primordiales formados en el ovario continúan su crecimiento secuencial a través de toda la vida y muchos de estos procesos se inician aun durante la vida fetal en las búfalas [43]. Una vez los folículos primordiales comienzan a crecer, las células de la granulosa proliferan para formar estructuras multilaminares conocidas como folículos preantrales. Estos folículos preantrales crecen con la subsecuente formación de un espacio lleno de líquido (antro) y una capa de células de la teca bien diferenciada. Los folículos con un antro se conocen como folículos antrales. Los mecanismos que regulan la activación y posterior crecimiento de los folículos primordiales aún siguen sin entenderse del todo. Sin embargo, su crecimiento es considerado como independiente de las gonadotropinas, pero probablemente sean dependientes de la presencia de la interacción celular ovocito/granulosas y de la secreción de factores locales tales como las activinas, inhibinas y factores de crecimiento epidermal [3]. Con base en estudios in vitro en búfalas se considera que el crecimiento de los folículos preantrales a folículos antrales requiere de 3-4 meses [60-64]. El diámetro de los folículos preantrales varía de 100 a 200 μm al inicio del cultivo y crece hasta 600-800 μm después 80 días de cultivo in vitro [62,65]. El crecimiento de folículos preantrales es independiente de las gonadotropinas, sin embargo, parece ser más dependiente de factores intraováricos locales.

1.6. Crecimiento folículo antral

Las etapas posteriores del desarrollo del folículo antral en búfalas se caracterizan por dos o tres olas de crecimiento folicular durante cada ciclo estral. Las olas de crecimiento folicular se observan durante el período prepuberal, la pubertad, en anestro, en gestación y en el posparto. Cada ola decrecimiento folicular se caracteriza por el reclutamiento de un grupo de folículos que continúan creciendo aproximadamente hasta 6 a 8 mm de diámetro. De este grupo de folículos en crecimiento, se selecciona un folículo para que continúe creciendo y se convierta en el folículo dominante.

Hay una serie de términos que son particularmente relevantes al describir las olas foliculares basándose en observaciones ecográficas [66]. El día de aparición de la ola folicular es el primer día en que se detecta el crecimiento de la cohorte de folículos empleando la ultrasonografía. El reclutamiento de folículos se usa a menudo como sinónimo de aparición [67], sin embargo, es definido más exactamente como el crecimiento de folículos que se han convertido dependiente a la gonadotropina [68]. Esto generalmente se evidencia cuando los folículos tienen 4-6 mm de diámetro en la vaca y 2-4 mm de diámetro en la oveja. La selección del folículo es el proceso que resulta en una disminución en el número de folículos en crecimiento en una ola, al número específico de la especie de los folículos que ovulan. Este proceso mal definido probablemente se produce durante un período de tiempo y se cree que este termina cuando el folículo dominante(s) ha sido seleccionado de los folículos subordinados tal como se ve por la diferencia de tamaños de los folículos. El momento en el cual hay una divergencia en la tasa de crecimiento se conoce como desviación [67]. El folículo dominante es el que continúa desarrollándose cuando se inhibe el crecimiento y desarrollo de los otros folículos de la misma ola. Los folículos subordinados son los folículos restantes que regresan en presencia del folículo dominante(s).

1.7. Dinámica folicular durante el ciclo estral

El uso de la tecnología de ultrasonido en la reproducción animal ha allanado el camino en la recopilación de datos sobre la dinámica folicular ovárica en vacas [69-71]. Estos estudios demostraron que el desarrollo folicular ocurre en olas durante el ciclo estral, cada ola se caracteriza por el desarrollo sincrónico de un grupo de folículos. El crecimiento folicular ovárico en las búfalas es similar al observado en la vaca y se caracteriza por olas de reclutamiento folicular, crecimiento y regresión [15,16,17,50]. Los autores de este artículo y muchos otros (Tabla 1) han mostrado que las búfalas presentan típicamente dos y tres olas foliculares durante un ciclo estral, comenzando la primera ola alrededor del Día 0 (día de la ovulación). En cada ola de crecimiento folicular, un folículo dominante se desarrolla y suprime a los otros folículos. El folículo dominante crece y alcanza el diámetro máximo a la mitad del ciclo estral; al mismo tiempo, con altos niveles de progesterona durante la mitad del ciclo, la ovulación no se produce; comienza la regresión del folículo dominante permitiendo que se produzca una nueva ola de crecimiento folicular. El folículo dominante que se desarrolla durante la última ola de crecimiento en cada ciclo estral es el folículo ovulatorio (Fig. 2).

Figure 2. Perfil del crecimiento promedio del primer y segundo folículo dominante en búfalas de agua con un ciclo de dos olas [50].

Con base en análisis ecográficos, la mayoría de los animales tienen una o dos olas de crecimiento folicular durante la fase lútea y una sola ola de desarrollo folicular (ola ovulatoria) durante la fase folicular. Se denomina cohorte a un grupo de folículos de tamaño similar en crecimiento muy sincrónicos. La aparición marca el comienzo de una ola que consta de 3 a 6 folículos y en el primer día se observa en la nueva ola un folículo de 4-5 mm. El comienzo de la selección no puede determinarse por ecografía, sin embargo, el final de la selección ocurre simultáneamente con el inicio de la dominancia.

La desviación es cuando el crecimiento de un folículo (dominante) ocurre a un ritmo más rápido que los otros folículos (subordinados) en la cohorte. La dominancia ocurre cuando el folículo más grande en una ola tiene de 1 a 2 mm más que el siguiente folículo más grande y cesa el crecimiento de todos los folículos subordinados y estos entran en atresia. La pérdida de la dominancia marca el fin de una ola y se detecta la aparición de la siguiente ola folicular. El perfil de crecimiento de un folículo dominante se divide en tres fases distintas, crecimiento, estática y regresión. La fase de crecimiento del folículo dominante comienza en el día de su aparición y finaliza el día en el cual el diámetro del folículo deja de crecer. La fase estática va desde el primer día en que el folículo deja de crecer (fin de la fase de crecimiento) hasta el día anterior cuando el diámetro del folículo comienza a decrecer. La fase de regresión es a partir del último día de la fase estática hasta que el folículo ya no es detectable, lo cual generalmente ocurre cuando alcanza 4 a 5 mm de diámetro. En un ciclo estral con dos olas foliculares, la primer ola comienza aproximadamente en el Día 1 (Día 0 = día de la ovulación] y la segunda ola comienza aproximadamente en el Día 11 [16,50]. El tamaño máximo de cada folículo dominante (15 mm) se alcanza en los días 9 y 21 del ciclo estral para la primera y segunda ola, respectivamente (Tabla 2). Se ha informado que la desviación de los folículos ocurre a los 2,6 ± 0.2 días después de la ovulación y que el diámetro del folículo dominante y el folículo subordinado más grande no difieren en tamaño al momento de la desviación durante la primera ola del desarrollo folicular en las novillas búfalas [73]. Se informó además de que la adquisición de la capacidad ovulatoria se produjo cuando el folículo dominante alcanzó 8,5 mm de diámetro después del tratamiento pLH [73].

En un ciclo de tres olas, las olas aparecen en promedio en los días 1, 9 y 16 [16,17,74]. No hay ninguna diferencia entre la segunda y tercera ola del ciclo con relación el día de aparición de la primera ola; la segunda ola aparece más temprano en un ciclo estral con tres olas que con dos olas. La duración promedio de los intervalos al estro y ovulación y la duración media de la fase lútea son mayores en el ciclo de tres olas que en el de dos [16,49]. En general, se ha acordado que el número de olas foliculares en cada ciclo esta correlacionado con la longitud del ciclo, lo cual a su vez depende de la vida útil del CL. La iniciación de la segunda ola comienza 2-3 días después de iniciarse la fase estática del primer folículo dominante lo que sugiere que el folículo dominante pierde su dominancia al comienzo de la fase estática. Los folículos dominantes son funcionalmente activos (E2-dominante; no atrésicos) entre los días 5 y 10 del ciclo estral con base a los análisis de niveles de E2 y P4 [75] sugiriendo que la fase de crecimiento y la fase estática del folículo dominante de la primera ola dura hasta 10 días. La dominancia funcional se pierde en algún momento entre la fase temprana y la última fase estática, aun cuando los folículos son morfológicamente dominantes [69].

Los folículos subordinados de cada ola folicular dejan de crecer después de unos pocos días y la nueva ola no aparece mientras que el folículo dominante se encuentre en su fase de crecimiento o al inicio de su fase estática [50]. El final de la fase de crecimiento del primer folículo dominante es seguido por un pico en el nivel de FSH [23] correspondiente al tiempo de aparición de la segunda ola folicular. El aumento de FSH se relaciona funcionalmente con el reclutamiento y el desarrollo de la siguiente ola.

A diferencia de ganado, las búfalas de agua ocasionalmente muestran un crecimiento folicular atípico, que se caracteriza por una ola de crecimiento folicular (Fig. 3) durante el ciclo estral [15,50]. Los animales con un ciclo de una ola tienen un intervalo inter-ovulatorio significativamente más corto y un ciclo más corto en comparación con los ciclos de dos olas. La única ola en un ciclo de una ola aparece significativamente más tarde que la primera ola de un ciclo de dos olas. El folículo dominante de un ciclo de una ola muestra tres fases distintas de crecimiento, es decir, fase de crecimiento, fase de regresión y fase de re-crecimiento culminando en la ovulación. Este patrón de crecimiento folicular difiere del perfil de crecimiento del folículo dominante ovulatorio de los ciclos de dos y tres olas, el cual se caracteriza por el crecimiento continuo sin ninguna regresión hasta la ovulación al final del ciclo [16,17]. El folículo dominante de un ciclo una sola ola regresa considerablemente alrededor de la mitad del ciclo después de un crecimiento inicial, al tiempo que conserva su dominancia funcional y el mismo folículo se convierte en ovulatorio después de un crecimiento lento pero constante desde el día 15 en adelante. La tasa de crecimiento lineal del folículo dominante solitario de un ciclo de una ola es significativamente mayor durante la fase de crecimiento en comparación con la de la fase de re-crecimiento. Con un mayor tamaño y bajo una concentración plasmática de progesterona más elevada, la tasa de crecimiento del folículo dominante ovulatorio es más lenta durante la fase de re-crecimiento. No hay diferencia significativa entre el tamaño del futuro folículo dominante y el folículo subordinado más grande al momento de la aparición de la ola tanto en ciclos de una como de dos olas. Sin embargo, el folículo dominante crece a un ritmo más rápido y su diámetro es significativamente mayor en el Día 3 para el primer folículo dominante de un ciclo de dos olas y en el Día 4 para el folículo dominante de un ciclo de una ola y el folículo dominante ovulatorio de un ciclo de dos olas [50].

Figura 3. Perfil de crecimiento promedio de un folículo dominante en búfalas de agua con un ciclo de una ola.

El que las búfalas muestren un crecimiento folicular atípico de una ola durante el ciclo estral puede atribuirse a:

1. Un menor número de folículos primordiales en la reserva.
2. Un retraso en la liberación de FSH en el momento de la regresión del folículo dominante o
3. Cantidad inadecuada de FSH responsable de la aparición de una nueva ola folicular [18].
   Es posible que esta característica sea específica de la raza o hereditaria.

El folículo dominante preovulatorio se desarrolla con igual frecuencia en los ovarios con o sin un CL [16]. Por el contrario, otro reporte sugiere que el folículo dominante preovulatorio se desarrolla en el ovario contralateral al CL en un ciclo de dos olas foliculares [50]. En la vaca, el primer folículo dominante generalmente se desarrolla en el ovario que contiene al CL [76]. Estas observaciones sugieren que hay una influencia intra-ovárica positiva del CL sobre el crecimiento del folículo dominante de la primera ola de un ciclo de dos olas (anovulatorio) y una influencia negativa sobre el crecimiento del folículo preovulatorio tanto en los ciclos de una como de dos olas. Algunos autores no han logrado observar un patrón aparente de ovulación alterna en la vaca [77,78], y en las búfalas [15,16], mientras que otros han observado una relación entre estas estructuras [69]. Hay muy poca variación entre el número de folículos en las diferentes olas al momento de su aparición en búfalas [16,50], lo que sugiere que el número de folículos reclutados depende del individuo. No hay información disponible en relación a la heredabilidad de esta característica; sin embargo, la selección de un animal como donador para el programa de transferencia de embriones basado en el número de folículos por onda, es un aspecto prometedor. Existe una correlación positiva entre el número de folículos pequeños al comienzo del tratamiento superovulatorio y la respuesta superovulatoria [79].

1.8. dinámica folicular durante el período prepuberal

El desarrollo de los folículos ováricos se caracteriza por olas de crecimiento folicular en novillas de búfala prepúberes entre los 5 a 9 meses de edad [18]. Se ha informado de 2 a 6 olas foliculares regulares durante 50 días de observación diaria a través de la ecografía. El intervalo entre dos olas foliculares fue de 9.9 ± 2.8 días y el diámetro mayor del folículo dominante fue de 8.4 ± 1.2 mm. Las tasas de crecimiento de los folículos dominantes fueron significativamente más rápidas que la de los correspondientes folículos subordinados. La fase estática duró más tiempo en los folículos dominantes en comparación con los folículos subordinados; sin embargo, la fase de regresión fue similar entre los folículos dominantes y subordinados. Se observaron también algunas olas foliculares cortas con duración de 6.1 ± 1.2 días. Igualmente, se ha informado de un patrón de desarrollo folicular regular en una novilla de búfala Murrah prepúber de 20-24 meses de edad [19], lo cual apoya el concepto de que los mecanismos de la dominancia folicular y el patrón de crecimiento en ola folicular están operando durante la vida prepuberal. En promedio, se registraron 3 olas completas por novilla durante el período de observación de 42 días; sin embargo, no se registraron ovulaciones en estos animales. El intervalo promedio entre la aparición de dos olas consecutivas fue de 10.40 ± 0.86 días. El promedio de duración de la ola folicular fue de 15.14 ± 1.08 días, la mayoría de las olas (81%) persistieron entre 10-20 días y solo se observaron 2 olas cortas (6-8 días) y dos olas de larga duración (22-24 días), lo que sugiere que el crecimiento folicular de una ola se presenta también durante el período pre-puberal. La incidencia de olas de corta duración puede sugerir ya sea inmadurez de la regulación hormonal de la aparición de la ola folicular y la dominancia, o la presencia de un efecto residual de las hormonas gonadotropicas en el reclutamiento de folículos adicionales para desarrollo, aunque por un período corto. Del mismo modo, una ola de mayor duración puede reflejar tanto un retraso en la liberación de FSH o su cantidad inadecuada que es responsable de la aparición de una nueva ola folicular [23]. Sin embargo, Presicce y col., [18] informaron que la liberación de FSH estuvo menos claramente asociada con la aparición de la ola principal en las terneras búfalas y sugirieron que solo un nivel basal de FSH en asociación con la regresión de un folículo dominante puede ser suficiente para disparar el desarrollo de una nueva ola folicular. Existe una gran variación en la duración de la ola folicular, promediando de 9.9 ± 2.8 a 15.14 ± 1.08 días durante el período prepuberal en búfalas de agua.

El tamaño de un folículo dominante en terneras de búfala entre 5-9 meses de edad (8.4 ± 1.2 mm) y en novillas prepúberes entre 20-24 meses de edad (9.55 ± 0.24 mm) es menor [18,19] que en búfalas adultas (rango 13-15 mm) [15,16,50]. Esto sugiere que el tamaño máximo del folículo dominante aumenta gradualmente con la edad hasta alcanzar el tamaño equivalente al del folículo ovulatorio. En el inicio de la pubertad, la capacidad de respuesta de la hipófisis a la GnRH secretada por el hipotálamo aumenta resultando en la secreción pulsátil de gonadotropinas, más importante aún la secreción de la hormona luteinizante (LH), que está involucrada en la maduración final del folículo dominante. El folículo maduro comienza a secretar más estradiol, el cual ejerce un efecto de retroalimentación positiva sobre la hipófisis para producir el pico del LH que resulta en la ovulación del folículo dominante maduro [80]. El número promedio (8.48 ± 0.28) de folículos pequeños reclutados en una cohorte es comparativamente mayor durante el período prepuberal que en animales adultos (rango 3-6) sugiriendo que la tasa de atresia folicular es más elevada durante el período prepuberal que en los animales adultos.

1.9. Dinámica folicular durante el período posparto

La reanudación de la ciclicidad en búfalas posparto se ha atribuido a un incremento de FSH plasmático produciendo a un nuevo reclutamiento de folículos y el establecimiento de la dominancia folicular. La disfunción pituitaria es un factor importante responsable de la inactividad ovárica posparto. A pesar de d la capacidad de la GnRH exógena para liberar LH y FSH, la característica de un pico preovulatorio se restaura en el Día 20 después del parto [81]. Además, otros factores son responsables de la reanudación de la ciclicidad en los búfalos tales como suplementos alimenticios antioxidantes [82], el cambio de luz-oscuridad durante los meses junto con las condiciones climáticas frías o calientes [83]. La reanudación posparto de la actividad ovárica y el ciclo estral en las búfalas está condicionada por la estación del año y la madurez reproductiva de los animales [84,85].

Los ovarios se caracterizan por el crecimiento y regresión de varios folículos pequeños (hasta de 5 mm) y de tamaño medio (> de 5 y <10 mm de diámetro) hasta la detección del primer folículo dominante posparto (= 10 mm) y/o ovulatorio durante el período temprano del posparto [52]. Los folículos mayores o iguales a 3 mm de diámetro registran un incremento gradual hasta los primero 15-20 días después del parto, después, presentan una fluctuación causada por la selección periódica de folículos en crecimiento del grupo disponible. Los folículos mayores o iguales a 3 mm de diámetro han sido registrados en significativamente mayor número en el ovario contralateral al cuerno previamente grávido inmediatamente después del parto [51]. El intervalo entre el nacimiento y la detección del primer folículo grande fue significativamente menor (P<0.01] en el ovario contralateral al cuerno previamente grávido durante el primer mes después del parto [86].

La primera ovulación posparto fue igualmente distribuida en el ovario ipsilateral (n=7) y contralateral (n=7) en el cuerno uterino previamente grávido entre los 14 y los 28 días posparto; sin embargo, la primera ovulación posparto ocurrió significativamente antes (P<0.05) en el ovario contralateral al cuerno previamente grávido. Tal diferencia entre los dos ovarios persiste durante las primeras 3 semanas hasta que se logra alcanzar un balance hacia el final del primer mes después del parto. Entre búfalas Mediterráneas Italianas primíparas (n=10) y pluríparas (n=10), dentro del período de 60 días de seguimiento ecográfico transrectal de los ovarios, la primera ovulación posparto se registró en 4 y 8 animales respectivamente [51]. Los autores informaron que el intervalo promedio entre el parto y la primera ovulación posparto fue de 25.5 ± 6.9 días en búfalas primíparas y 15.5 ± 1.3 días en búfalas pluríparas. De manera similar, el promedio del intervalo de la primera ovulación posparto fue de 23.1 ± 1.5 días y 14 de los 20 animales ovularon hacia los 28 días posparto en búfalas Mehsana lactantes [44]. Por el contrario, se ha informado que la primera ovulación posparto ocurre más tarde (52,67 ± 8,02 días) en 3 de 12 búfalas Murrah lactantes durante dos meses después del parto [87]. La primera ovulación posparto está generalmente asociada con la ausencia de signos evidentes de estro en la mayoría de los animales. La primera ovulación posparto se produjo en 12 de 20 búfalas Italianas Mediterráneas [51] y en 19 de 20 búfalas Mehsana [52] hacia los 60 días posparto durante la temporada de cria. El regreso anticipado del desarrollo folicular activo y la aparición de la primera ovulación posparto en muchos animales, al final del primer mes posparto, demostró la capacidad del ovario de la búfala para reanudar la actividad ovárica temprana después del parto. Esto sugiere que la capacidad de la respuesta ovárica puede no ser la razón principal de la duración variable del periodo de anestro posparto observado comúnmente en búfalas [52]. Se ha informado que el intervalo promedio a partir de la aparición de la ola hasta la primera ovulación posparto es de 14.0 ± 1.6 días en búfalas Murrah [88].

Se ha informado que en búfalas durante el período posparto temprano, después de la primera ovulación posparto, surge una nueva ola folicular que conduce a la ovulación. La mayoría de los animales muestra un ciclo estral corto con una fase lútea corta poco después del parto en bufalas Mediterráneas Italianas [51], Murrah [88], Mehsana [89] y Thai [46]. La longitud de tales ciclos varía entre 8 a 12 días y no está afectada por el número de partos de los animales. El ciclo estral corto se caracteriza por una ola folicular que culmina en ovulación. Se ha informado de diferencias no significativas en el tamaño del folículo ovulatorio entre ciclos estrales cortos y los ciclos normales. El patrón de crecimiento en un ciclo corto de una sola ola folicular, es diferente al patrón de crecimiento en un ciclo estral de duración normal de una sola ola folicular. El folículo ovulatorio de una sola ola folicular presenta solo una fase de crecimiento después de su aparición antes de la ovulación, mientras que en bufalos con un ciclo estral normal de una sola ola, presenta tres fases diferentes de crecimiento folicular es decir, fase de crecimiento, regresión y fase atípica de re-crecimiento [50]. Con la lisis temprana del CL, el primer folículo dominante ovula durante un ciclo estral corto, porque las concentraciones plasmáticas de progesterona disminuyen con la regresión del CL. Los animales que tienen un ciclo estral corto, muestran una fase lútea corta y tienen bajas concentraciones de progesterona (< 1.0 ng/ml] lo que indica fallas en la apropiada formación del cuerpo lúteo. Se ha informado sobre una fase lútea corta al comienzo del ciclo estral después de un anestro posparto en búfalas de agua [90,91]. Enseguida de la primera ovulación posparto, los niveles plasmáticos de progesterona están correlacionados con la actividad morfológica y funcional del CL en la búfalas [92]. La disminución temprana de los niveles de progesterona plasmática en tales ciclos puede atribuirse a al corto período de vida del CL [73]. Parece ser que los cuerpos lúteos asociados con ciclos cortos tienen un período de vida corto como resultado de: a) caída del apoyo luteotrópico, b) falla del tejido lúteo para reconocer una luteotropina y/o c) aumento de la secreción de un agente luteolítico, principalmente PGF2α, al involucionar el útero durante el período de posparto temprano [93,94]. Estas búfalas posparto muestran ciclos estrales normales promediando 19 a 22 días de duración. Tales animales muestran una o dos olas foliculares de crecimiento durante el ciclo estral [51]. Las búfalas que nunca ovularon durante los primeros 60 días posparto, aun así mostraron cierto grado de actividad folicular ovárica [51,87]. Se ha informado de tal actividad en ambos ovarios o más predominantemente en uno de los dos sin tener en cuenta el sitio del CL de gestación [51].

1.10. Dinámica folicular durante la gestación

La dinámica folicular durante el embarazo temprano en las novillas de búfalo (n = 10) se estudió a partir del día 18 al día 60 de gestación [20]. El desarrollo folicular se caracterizó por olas de diferente patrones; tres animales presentaron olas foliculares de 9.67 ± 0.58 días de duración. Las siete novillas restantes presentaron un desarrollo folicular irregular con tres diferentes patrones. El primer patrón irregular se caracterizó por olas de 7.40 ± 1.26 días de duración, con un folículo dominante que alcanzó un diámetro máximo de 11.4 mm. El segundo patrón irregular presentó olas con una duración de 6.44 ± 1.81 días, con un folículo dominante que alcanzó un diámetro máximo de 9.0 mm. El tercer patrón irregular se caracterizó por períodos de crecimiento folicular subsecuentes sin fases definidas entre los 18 a 60 días de gestación.

Es posible que el desarrollo normal de los folículos grandes durante la gestación no juegue un papel fisiológico importante para la gestación, pero estos están presentes como salvaguarda en caso de que suceda la mortalidad embrionaria. La presencia de un folículo grande aseguraría un retorno relativamente rápido al estro de dos maneras: i) el estradiol del folículo grande estaria disponible para la cascada de estradiol-oxitocina- PGF2α que se cree que causa la luteólisis [95] y posteriormente ii) un folículo se desarrollaría y estaría disponible para la ovulación una vez que la progesterona hubiera regresado a la concentración basal, evitando así un periodo de anestro prolongado después de la mortalidad embrionaria. Un estudio reciente [96], documentó la presencia de folículos de < 6 mm, 6-10 mm y >10 mm tanto entre los 1-3 meses y 3-6 meses de gestación, sobre tractos reproductivos de búfalas de Arabia Saudita provenientes del matadero. No se dispone de descripciones de las características del crecimiento folicular en búfalas durante el último trimestre de gestación ni cerca al parto.

1.11. Relación temporal de las hormonas, factores de crecimiento y crecimiento folicular

La foliculogénesis puede dividirse en tres estados diferentes: (1) reclutamiento, estado durante el cual un grupo de folículos en crecimiento comienza a crecer rápidamente; (2) selección, proceso en donde se seleccionan los folículos para su crecimiento posterior y (3) dominancia, proceso en el cual el folículo dominante entra en un desarrollo rápido mientras que se suspende el crecimiento de los folículos subordinados. Este patrón de desarrollo folicular está asociado con cambios en la expresión de mRNA que codifica los receptores de gonadotropina [97,98] y las enzimas esteroides [99] permitiendo a los folículos seleccionados, cuando son expuestos al medio ambiente hormonal necesario, ovular en respuesta al aumento de las gonadotropina preovulatoria. Las concentraciones intrafoliculares de IGF-1 producen los cambios en la expresión de los genes asociados con la esteroidogénesis, lo que puede afectar significativamente el desarrollo folicular [98]. Las señales endocrinas (por ejemplo: gonadotropinas, inhibinas y esteroides) así como los factores de crecimiento producidos localmente, son responsables del control y coordinación de estos procesos. La expresión temporal y espacial de las muchas clases de factores de crecimiento y sus receptores ha sido identificada en muchas especies durante el desarrollo folicular. En rumiantes, se requieren 40 días para que un folículo antral temprano alcance el estado preovulatorio [100,101]. Esquemáticamente, el desarrollo folicular antral implica dos fases. En la primera fase, en las búfalas los folículos crecen lentamente hasta 3 a 4 mm y está directamente relacionado con la proliferación de células de la granulosa. Esta fase no es dependiente del suministro de gonadotropina. La segunda fase corresponde al desarrollo final de los folículos antrales hasta el estado preovulatorio. Durante esta fase, el crecimiento folicular es rápido debido esencialmente al crecimiento del antro. Además, el desarrollo terminal se caracteriza aumentos importantes en la capacidad esteroidogénica y la capacidad de respuesta de las células de la granulosa a la FSH y LH. Esta fase es estrictamente dependiente del suministro de la gonadotropina. En las búfalas, las fluctuaciones en las concentraciones de FSH están temporalmente asociadas con las olas de crecimiento folicular terminales, sugiriendo un efecto estimulatorio de la FSH sobre la aparición de cada ola folicular [18]. Sin embargo, no se entienden bien los mecanismos que conducen a la selección de un folículo dominante y la atresia de otros folículos gonadotropino-dependientes de la misma ola. La evidencia aumenta sugiriendo que los factores de crecimiento modulan la foliculogénesis. Los factores de crecimiento son péptidos ubicuos, que actúan de manera paracrina y/o endocrina y están involucrados en la regulación de la proliferación, diferenciación y supervivencia celular. Los diferentes factores de crecimiento han sido clasificados en familias separadas, con base en sus estructuras y su actividad biológica. Se han descubierto e identificado las familias del factor de crecimiento epidermal EGF, la familia del factor de crecimiento fibroblastico FGF, la familia del factor de crecimiento derivado de plaquetas PDGF, la familia del factor de crecimiento insulínico IGF, la familia del factor de crecimiento transformante, β TGF-β incluyendo la inhibina y la activina y los factores de crecimiento hematopoyético (citoquinas). Las concentraciones intrafoliculares de IGF-1 producen cambios en la expresión de los genes asociados con la steroidogenesis y pueden afectar significativamente el desarrollo folicular [98]. El crecimiento de los folículos preantrales en bufalos aumenta durante el cultivo in vitro en presencia de IGF, FGF y EGF [61,65,102]. Sin embargo, el conocimiento de los elementos de este sistema es complejo y su papel exacto en la foliculogénesis es aún hipotético ya que pertenecen a un sistema complejo hechos ellos mismos de factores, sus receptores y proteínas de unión [103].

Se ha establecido a partir de estudios in vitro en varias especies animales que los factores de crecimiento modulan la supervivencia, proliferación y diferenciación de las células foliculares, actuando en interacción con las gonadotropinas. Los diferentes papeles biológicos de los factores de crecimiento de los rumiantes domésticos sobre las células foliculares se resumen enseguida:

Supuestamente, la selección fisiológica del folículo dominante ocurre 2 días antes de la aparición de la ola folicular [104], puesto que el folículos más grande contienen concentraciones casi 10 veces mayores de estradiol en el líquido folicular comparado con el siguiente folículo más grande (subordinado). Los niveles más altos de estradiol en el líquido folicular están sustancialmente asociados con la primera porción de la divergencia de la ola; tal como se had detectado mayores concentraciones de estradiol en el presunto folículo dominante frente a los folículos subordinados en el Día 2. El cambio intrafolicular más temprano que diferencia un futuro folículo dominante de otros folículos en crecimiento es el aumento de la capacidad de producir estradiol-17β [105].

El número de receptores de FSH están significativamente reducidos en los folículos subordinados en el Día 4 lo que sugiere que la concentración de estradiol juega un papel en la divergencia en la tasa de crecimiento entre el folículo dominante y los subordinados. El nivel de estradiol en el líquido folicular puede tener un papel clave en la determinación del destino fisiológico de los folículos durante la selección del folículo dominante de la primera ola y puede ser utilizado como un marcador fiable para predecir qué folículo en la cohorte en crecimiento de folículos de 5 a 8,5 mm será el folículo dominante [106].

El periodo de crecimiento continuo del folículo dominante está asociado temporalmente con el nivel basal de FSH en la sangre, lo que indica que el folículo dominante puede crecer más fácilmente que los folículos subordinados en virtud de las concentraciones reducidas de FSH. Se ha notado una disminucion en el número de receptores de FSH por célula en el Día 4 a 6, sin embargo, el número de receptores de FSH por folículo y el número de receptores de LH por folículo o por célula no disminuye. No hay diferencia en las concentraciones de estradiol intrafolicular, en las concentraciones de progesterona o en la taza de estradiol:progesterona entre los Días 2 a 6. La pérdida de la dominancia funcional ocurre hacia el Día 10 como lo indica la aparición de una nueva ola folicular [107]. Hay una disminución en el número de receptores tanto de FSH como de LH por folículo, y una disminución significativa en las concentraciones de estradiol en el líquido folicular. La disminución de la concentración de estradiol puede indicar una reducción en la actividad de la aromatasa en el folículo dominante. Se ha demostrado que una disminución en la concentración de estradiol en el Día 7 y 11 corresponde a una disminución paralela de la concentración de androstenediona intrafollicular.

Por lo tanto, una disminución en el andrógeno como substrato para la biosíntesisde estrógeno puede contribuir a la regresión del folículo dominante de la primera ola folicular [108].

Las concentraciones de progesterona intrafolicular son más altas en el folículo dominante en el Día 10 que en el Día 2. Además, la ración de estradiol a progesterona disminuye en el folículo dominante del Día 2 al Día 10. Se ha demostrado que las menores concentraciones de estradiol y las concentraciones de progesterona aumentadas están asociadas con atresia folicular [109].

Curiosamente, en becerras los folículos de más de 9 mm de diámetro tienen una capacidad baja para producir estradiol (10 veces menos que en la vaca) a pesar de que las células de la teca producen testosterona en cantidades similares a las observadas en las vacas [68].

La hipótesis actual sobre el papel de los factores de crecimiento y sus proteínas de unión en el desarrollo de los folículos ováricos se resume a continuación.

Desarrollo de pequeños folículos antrales

El desarrollo de pequeños folículos antrales no es estrictamente dependiente de gonadotropinas para el inicio del crecimiento del folículo preantral en búfalas, ya que la mayoría de los estudios in vitro no suplementan gonadotropinas a folículos preantrales en cultivo [60,62,63,64,102]. Estos estudios sugirieron que los factores de las familias FGF, EGF y IGF influyen directamente en la tasa de crecimiento folicular mediante el aumento de la proliferación de las células de la granulosa. En estos folículos, la vascularización está poco desarrollada, lo que sugiere que la regulación paracrina podría ser de particular importancia.

Por ejemplo, TGF-α e IGF-II sintetizados por las células de la teca, pueden jugar un papel determinante en el control de la proliferación de células de la granulosa adyacentes. Sin embargo, no puede excluirse una acción endocrina de los factores de crecimiento. La administración de GH estimula el crecimiento de pequeños folículos antrales in vivo, probablemente por un mecanismo indirecto que involucra la IGF-I de origen endocrino; además, está bien establecido el efecto estimulante de la FSH sobre el crecimiento de pequeños folículos antrales en diferentes especies animales. Del mismo modo, la aceleración del crecimiento del folículo preantral en bufalas se produjo in vitro cuando se suplemento el sistema de cultivo con gonadotropinas [61].

Aparte de los factores de crecimiento, las células somáticas desempeñan papeles importantes en el desarrollo de folículos preantrales. La presencia de folículos antrales [102] y células somáticas ováricas tales como las células del cumulo, células de la granulosa o células mesenquimales del ovario, mejoraron el crecimiento de los folículos preantral durante el cultivo in vitro [62-64,102]. Un estudio reciente demostró el papel del óxido nítrico sobre el crecimiento y la supervivencia de los folículos preantrales de bufala durante el cultivo in vitro[110]. La presencia de un folículo dominante o la etapa del ciclo estral no tuvo ningún efecto sobre las tasas de crecimiento in vitro, la supervivencia y la formación de antro en folículos preantrales pequeños o grandes en cultivo [9] confirmando que el crecimiento de los folículos preantrales es independiente de las gonadotropinas, pero parece ser más dependiente de factores intra-ovárico locales. Aunque muchos estudios in vitro se han realizado para definir el papel de los factores de crecimiento, los procesos de desarrollo de folículos primordiales a foliculos preantral y posteriormente a folículos antrales en vivo son complejos y requieren más estudios.

Desarrollo folicular final

El crecimiento terminal folicular es un proceso estrictamente dependiente de gonadotropinas correspondiente a la iniciación de las olas foliculares, la selección de un folículo(s) dominante y la maduración terminal del folículo preovulatorio(s). Se ha establecido que un incremento en las concentraciones plasmáticas de FSH precede a cada ola de crecimiento folicular en búfalas y puede determinar su iniciación [18], mientras que una disminución en las concentraciones de FSH coincide con el aumento de la secreción de inhibina y estradiol por el folículo dominante(s), y se asocia con la rápida regresión del folículo no dominante(s). Durante la fase folicular del ciclo, el fuerte aumento de la pulsatilidad de LH, asociado con un aumento dramático en los receptores de LH en las células de la granulosa del folículo dominante(s), estimula el desarrollo terminal del folículo hasta la fase preovulatoria [111]. Por el contrario, durante la fase lútea, la baja frecuencia de pulsos de LH no puede mantener la maduración terminal del folículo dominante(s), por lo tanto, este regresa y secreta cantidades decrecientes de estradiol e inhibina, lo que permite un aumento en las concentraciones de FSH y la iniciación de una nueva ola folicular.

Los factores de crecimiento tienen sus papeles reguladores específicos en estos procesos. En primer lugar, los factores de crecimiento de las familias FGF, EGF e IGF pueden controlar el crecimiento de pequeños folículos antrales y de esa manera, participar con la FSH en la iniciación de las olas foliculares. En segundo lugar, los factores de crecimiento de la familia IGF son probablemente los jugadores principales en el proceso de selección del folículo dominante(s). Es importante destacar que el crecimiento folicular terminal se caracteriza por un fuerte aumento en la sensibilidad de las células de la granulosa a la FSH [112]. Se ha informado que en un estudio que involucró la maduración de ovocitos de bufala in vitro (IVM), el IGF-I y la FSH parecen actuar sinérgicamente como reguladores autocrinos y paracrinos de las células de la granulosa y por lo tanto promueven juntos la mitosis, la esteroidogénesis, y la síntesis de proteínas durante el desarrollo folicular en la búfala [113,114]. Esta alta capacidad de respuesta de las células de la granulosa a la FSH probablemente es el resultado de los sistemas de amplificación intrafoliculares, que involucran al estradiol y las IGFs, ya que ambas potencian la acción de la FSH sobre la diferenciación de las células de la granulosa. La concentración de IGFs biodisponibles incrementa fuertemente en los folículos antrales grandes durante el desarrollo terminal. Se piensa que sólo el folículo más "maduro" de una ola, es decir, el folículo con las concentraciones intrafoliculares más elevadas de estradiol e IGFs biodisponibles, será capaz de desarrollarse en presencia de concentraciones séricas disminuyentes de FSH. Además, se sugiere que la FSH y la LH, en la fase folicular temprana y tardía, respectivamente, pueden contribuir al aumento de las concentraciones de IGF biodisponible en el folículo dominante mediante la regulación de la síntesis y la proteólisis de las proteínas de unión a IGF, reforzando así el mecanismo amplificatorio. Además, las altas concentraciones de inhibina intrafoliculares en el folículo dominante pueden mejorar la producción de andrógenos estimulada por LH por las células de la teca, contribuyendo así al aumento de la síntesis de estradiol por las células de la granulosa y, como consecuencia, mantener la maduración terminal de este folículo.

Los miembros de la familia TGF, TGFα y TGFβ1, inhiben el crecimiento y supervivencia de los folículos preantrales, lo cual conduce a la inducción de la apoptosis en los folículos preantrales de bufala in vitro [114]. Recientemente se ha informado en bufalas de un papel definido de los factores de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y los receptores de VEGF durante el crecimiento folicular ovárico, el desarrollo y la maduración [115]. Estos autores concluyeron que el VEGF puede contribuir a la extensa proliferación capilar asociada con el aumento en el tamaño, la selección y maduración del folículo preovulatorio. El VEGF puede facilitar la maduración del folículo aumentando el suministro de nutrientes, hormonas y otras señales esenciales transmitidas por la sangre al folículo.