Brucelosis en búfalos

La brucelosis causa serias pérdidas económicas y es una zoonosis importante [1-5]. En muchos países se sabe que los búfalos están afectados con la Brucella abortus [6-8] y con menor frecuencia con la Brucella metilenses [9,10]. Al igual que en el ganado, se sabe que las infecciones por Brucella resultan en aborto al final de la gestación (6-9 meses) [11-14], en infertilidad [15-17], en infección latente de los ganglios linfáticos de la glándula mamaria con excreción de los organismos en la leche [10], sin embargo, los abortos son menos comunes en bufalas [10], siendo la enfermedad endémica en la mayoría de los países donde crían bufalos. La excreción de Brucella en la leche crea una posible amenaza para la salud humana, especialmente para los consumidores que utilizan leche y productos lácteos no pasteurizados [10]. Las evaluaciones diagnósticas de infecciones por Brucella en el búfalo han utilizado los métodos empleados en el bovino con una eficiencia similar o ligeramente más baja [18,19]. Los aislados de Brucella de búfalos de agua fueron menos virulentos en comparación con los del ganado [19]lo que sugiere un cierto grado de resistencia en búfalos hacia Brucella abortus. Incluso en los rebaños de bufalos que están altamente infectados con Brucella abortus, el 20% de los animales permanecen negativos según las pruebas serológicas y presumiblemente permanecen no infectados en todo momento [20].

La identificación de los genotipos específicos (Nramp 11 BB) entre las poblaciones de búfalos [21] con resistencia hacia la infección de Brucella abortus no solo ha confirmado la baja morbilidad presuntiva con Brucella abortus al compararlo con el bovino sino que también ha ofrecido la oportunidad de controlar esta enfermedad mediante la selección genética. Una incidencia ligeramente más baja de brucelosis ha sido registrada en búfalos en comparación con el ganado en estudios que evaluaron de forma simultánea la presencia serológica de brucelosis en estas dos especies [15,22-24], sin embargo, en otros estudios se registró una mayor incidencia de la enfermedad en búfalos en comparación con el ganado [25-27]. Por lo tanto, se puede presumir que los búfalos son diferencialmente afectados con Brucella abortus. Las medidas preventivas para la erradicación o control de la enfermedad en los países que crían búfalos son similares a las empleadas en el bovino y se ha aumentado la notificación de la enfermedad durante los últimos años. En este capítulo, se menciona la historia, los agentes etiológicos, diagnóstico, distribución, epidemiología, prevalencia, patogénesis, hallazgos a la necropsia, signos clínicos, respuesta inmunológica, muestreo, profilaxis y zoonosis de la brucelosis en el búfalo.

1. Historia

Los primeros indicios de la brucelosis se remontan a la Guerra de Crimea (1853-1856) en el que la Brucella spp. fue vinculada como el agente causante de la enfermedad humana [28]. Fue descrita por primera vez en 1859 en la isla de Malta por Marston. La primera identificación de Brucella spp. fue realizada por el Dr. Bruce en 1887 y en 1897 el Dr. Bang identificó a la Brucella abortus.

La brucelosis es una enfermedad infecciosa que puede afectar tanto a animales domésticos como silvestres y a los humanos, causada por varias especies del género Brucella [1,3,5]. Seis especies son conocidas en la actualidad; B. abortus, B. mellitensis, B. suis, B. canis, vB. ovis y B. neotomae, que se puede distinguir por la especificidad del hospedador o las características diferenciales de los microbios. Además, se está muestreando a B. pinnipediae y B. cotacae como nuevas especies [29]. Debido a su expansión global, la infección por B. abortus tiene diferentes nombres como la enfermedad de Bang, fiebre de Malta o fiebre ondulante.

El primer informe sobre la incidencia de la brucelosis en búfalos parece haberse originado en la India en 1918 en el Instituto de Investigaciones Veterinarias, Mukteshwar [30]. Posteriormente la brucelosis fue detectada en búfalos Egipcios [31] y en 1942, los organismos de Brucella abortus fueron aislados de búfalos en India [32], sin embargo, parece ser que los abortos causados por Brucella abortus fueron registrados primero en la India en 1964 [33] y la enfermedad fue descrita en 1968 [6]. En Paquistán los informes sobre la presencia de brucelosis apareció en 1967-1968 [34,35]. Muchos reportes sobre la seroprevalencia de la enfermedad han aparecido en muchos países a partir de entonces como en la India [12,13,15,22,36-39], Pakistán [8,24,40-46], Egipto [7,47,48], Irán [27], Iraq [49-51], Bangladesh [26,52,53], Vietnam [11], Sri Lanka [54-56], Argentina [57-59], Brazil [60-63], México [64], Trinidad [18,19,65,66] Italia [9,67], Colombia [68], Venezuela [69], y Turquía [70].

2. Agente etiológico

Las bacterias del género Brucella no son móviles, ni encapsuladas, no forman esporas, son bacilos pequeños Gram negativo (0.6-1,5 μm de longitud y diámetro y 0,5 a 0,7 μm de diámetro), las cuales crecen aisladas, en pares o en pequeños grupos.

La mayoría de las especies son catalasa positivas y la B. neotomaeoxidasa es catalasa negativa, son aerobios estrictos excepto B. ovisy B. abortus que son microaeróbica, necesitando 5-10% CO2 para su desarrollo [71]. A partir de la morfología de las colonias que crecen en medios sólidos, pueden clasificarse en lisas (L) rugosas (R), el factor de diferenciación de estas colonias está dado por la expresión de los lipopolisacaridos (LPS). Los LPS están constituidos por el lípido A, un oligosacárido (el núcleo) y el O-polisacárido, y estos componentes confieren la diferencia genética, bioquímica y biológica de cada especie de Brucella spp.. El agente causal de la brucelosis en búfalos es la B. abortus, la cual afecta tanto a animales de tiro como a razas lecheras [6], manifestándose principalmente por abortos durante el final de la gestación similares a las observadas en el ganado [33].

También se ha descrito a B. mellitensis como un agente causal de brucelosis en búfalos y en ganado [7,72], el biovar 3 es uno de los detectados con más frecuencia [9]. El riesgo de la trasmisión entre especies de Brucella spp. es alta en países con sistemas de producción mixta, tales como búfalos-ganado o sistemas de ovejas-cabras [74].

3. Diagnóstico

Para el diagnostico de B. abortus hay técnicas directas que detectan al agente o técnicas indirectas que identifican los anticuerpos generados por la exposición a la bacteria. Puesto que los microbios de Brucella son Gram negativos, se puede emplear la tinción de muestras de frotis de órganos o fluidos corporales con tinción de Ziehl-Neelsen modificada por Stamp, lo cual permite ver a los microorganismos teñidos sobre un fondo rojo o azul (Fig. 1).

Figura 1. Observación de un frotis de Brucella spp. con coloración de Stamp.

El aislamiento e identificación bacteriano es un diagnóstico inequívoco, de preferencia, se toman muestras de materiales abortados [74], pero el aislamiento puede realizarse en leche, calostro, o en muestras de otros tejidos [9]. Para optimizar el aislamiento bacteriano, es conveniente trabajar con un medio de cultivo específico (Fig. 2) como el agar dextrosa, agar de papa o medio de Farrell, los cuales cumplen con los requisitos nutricionales necesarios para el crecimiento bacteriano.. El medio de Farrell también tiene antibióticos específicos para Gram negativos, lo cual disminuyen el crecimiento de otros microbios. Los cultivos pueden mantenerse a 37°C con una atmosfera enriquecida con 5-10% de CO2 [75].

Figura 2. Observación de la Brucella spp. en medio de cultivo (Skyrrow).

El diagnóstico mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) permite no sólo detectar las muestras positivas para B. abortus sino también identificar más rápidamente los nueve biotipos de B. abortus descritos hasta ahora y algunas cepas de vacuna, comparado con las técnicas convencionales (bioquímica) [76-78]. Utilizando la técnica de PCR, Martínez y col., [79] fueron capaces de diferenciar B. abortus biotipo 5 de S19, en muestras de sangre de los búfalos que fueron positivos a la prueba de fijación del complemento.

Las técnicas serológicas utilizadas se basan en la detección de IgM, IgG o ambas, siendo la más difundida la prueba Rosa de bengala (PRB) [8,80,81] y la Prueba de Aglutinación Buferada en Placa (PABP). También se emplean la Prueba de Aglutinación Sérica (PAS), Fijación de Complemento (PFC) [18,80], ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas (i-ELISA y c-Elisa) [8,24,61,82,83] y ensayo por polarización de fluorescencia (EPF) [84,85]. Las técnicas de PRB y PABP se emplean para la detección y las técnicas PFC, ELISAs y EPF son técnicas confirmatorias con mayor sensibilidad y especificidad, reconocidas como prescritas para el análisis para el comercio internacional. La PSA se ha empleado eficazmente por muchos años en programas de vigilancia y control de la brucelosis bovina, pero no es considerada como una prueba obligatoria o alternativa. Los estudios con suero de búfalos han mostrado que el uso de EPF como técnica confirmatoria puede mejorar la sensibilidad y especificidad. La EPF es una técnica sencilla de ejecutar que permite también variaciones en los límites de sensibilidad y especificidad, dependiendo de la situación epidemiológica en cada país o región [84]. Las técnicas más ampliamente utilizadas en muestras de leche son la prueba de inmunoabsorción ligado a enzimas en leche (I-ELISA) y la prueba del anillo en leche (PAL), la cual puede usarse para muestras tomadas directamente del tanque de leche. La I-ELISA es más sensible y específica que la PAL, pero la PAL se emplea más por ser más práctica. En ambas pruebas, cuando una muestra es positiva, todas las hembras que contribuyeron a ese tanque de leche deben confirmarse individualmente con técnicas serológicas [86,87]. Se ha sugerido la combinación del cultivo y las técnicas de PCR como de mayor utilidad para el diagnóstico de Brucella sp. en la leche de búfala [88]. Algunos estudios demostraron que los resultados de la técnica de PABP son muy comparables entre las muestras de bovinos y búfalos. Usando c-ELISA, hay diferencias en el porcentaje de muestras positivas y negativas, esta variación depende principalmente de los límites establecidos para la sensibilidad y la especificidad [89]. Aunque estas técnicas se desarrollaron principalmente para el diagnóstico y control de la brucelosis en el ganado, se utilizan actualmente en muestras de búfalos con estudios de validación previos y evaluaciones epidemiológicas [83,90].

4. Distribución

La brucelosis causada por varias especies se distribuye en todo el mundo [3]. La brucelosis parece ser endémica en los países donde se crían búfalo incluyendo la India, Paquistán, Egipto, Sri Lanka y posiblemente muchos otros países más. Algunos países en Europa donde se crían bufalos, tal como Bulgaria, parecen estar libres de brucelosis [3]. De igual manera, se sabe que Australia, en donde se encuentran en número significativo de búfalos, está en la lista de países oficialmente libres de Brucella [3]. La presencia de Brucella en búfalos en muchos países de América del Sur y el Mediterráneo continúa siendo documentada a pesar de los muchos intentos para controlar la enfermedad en ganado y en los búfalos de agua. En muchos países en desarrollo, la brucelosis continúa siendo un problema debido a la falta de enfoques sistemáticos para el diagnóstico y control.

5. Epidemiología

Como en la mayoría de las enfermedades infecciosas, se necesitan tres factores para la trasmisión de la B. abortus: un huésped susceptible, el agente causal y el medio ambiente apropiado. En los búfalos de agua, una de las principales fuentes de infección son los líquidos expulsados durante el aborto o durante el parto aparentemente normal, los cuales contienen altas concentraciones de bacterias [6]. Grandes cantidades de bacterias son excretadas y contaminan los pastos y el agua [12], que es utilizada por los búfalos no sólo para beber, sino también para congregarse [32] y para la termorregulación.

6. Prevalencia

La prevalencia de esta enfermedad varía en los diferentes países o regiones donde se ha estudiado. Los principales factores que intervienen en esta variación son el número de animales muestreados y las técnicas serológicas usadas para el diagnóstico. La prevalencia en varios países varía de 3% a 20% (Tabla 1).

7. Patogénesis

La patogénesis de la Brucella spp. se ha revisado recientemente [98]. La vía de infección más común en búfalos es la oral, a través de las pasturas o el agua contaminada por trazas de abortos o líquidos del parto de búfalas infectadas. Otras formas efectivas son la conjuntival y la piel. La existencia de una lesión sobre la piel o la membrana mucosa vuelve a los tejidos permeables permitiendo la entrada de las bacterias. Después de la infección, la B. abortus es transportada a los ganglios linfáticos locales, en donde se produce hiperplasia linfoide y una respuesta inflamatoria aguda. Entonces migra a otros ganglios linfáticos, al hígado y a los pulmones (Fig. 3). En las hembras gestantes, los microbios tienen alta afinidad por el útero y glándula mamaria. La afinidad de la B. abortus por el útero grávido es debida a la presencia del eritritol, el cual se encuentra en altas concentraciones en la placenta y en los fluidos fetales [6,63,99]. Cuando el útero es invadido, la pared uterina es lesionada causando endometritis y lesiones en los espacios cotiledonarios. Tanto los fluidos fetales como los placentarios son entonces infectados en seguida, causando necrosis de las uniones carúncula-cotiledonarias, destrucción de las uniones feto-maternas y ocurre la muerte fetal debido a la interferencia en el suministro de oxígeno y nutrientes, manifestada por la agonía fetal. Dependiendo de la etapa de gestación en la cual se produce la infección, puede conducir al aborto desde el último tercio de la gestación hasta término, dando como resultado el nacimiento de un animal débil que finalmente muere a los pocos días después del nacimiento [89]. Los fetos o terneros no presentan lesiones patognomónicas, pero es común encontrar bronconeumonía. La placenta se observa edematosa, con cotiledones necrosados y lesiones inflamatorias [100]. Muchas de las hembras infectadas no abortaran otra vez, sin embargo, estas pueden diseminar bacterias a través de su leche [20].

Figura 3. Vía de entrada y transporte de organismos de Brucella hacia el órgano blanco.

8. Hallazgos a la necropsia

Los hallazgos a la necropsia en búfalos hembras incluyen placentitis necrótica, endometritis ulcerativa y reacciones inflamatorias. En el feto, se encuentra líquido sero-hemorrágico en las cavidades corporales y en la subepidermis, bronconeumonía, congestión, exudaos fibrinosos e infiltración celular. Los órganos fetales muestran evidencia de lesiones granulomatosas, necrosis focal y leptomeningitis granulomatosa [101-104]. En general, la brucelosis no produce mastitis clínica y no hay cambios aparentes en la leche, pero pueden observarse variaciones en el recuento de células somáticas.

9. Signos clínicos

Recientemente se han revisado las manifestaciones clínicas de la brucelosis en los animales domésticos [105]. En los rebaños de búfalos en donde está presente la B. abortus, los abortos son vistos como uno de los signos más obvios que se observan, generalmente evidente en el último tercio de la gestación [24], sin embargo, también ha habido abortos al inicio de la gestación [12]. Además también puede haber rebaños infectados sin abortos [90]. La retención de placenta es común en las búfalas que abortan por brucelosis. Los terneros pueden nacer normalmente. En los machos no hay signos clínicos comunes, pero tal y como se observa en ganado, puede haber epididimitis y orquitis [89]. En general no hay signos sistémicos debido a la acción de la B. abortus en las búfalas, aunque algunas búfalas pueden desarrollar fiebre transitoria. El higroma de la rodilla es común en las vacas afectadas pero no se ha descrito en la búfala. Es esencial detectar los animales infectados con una anamnesis apropiada de la población y con el diagnóstico de laboratorio.

10. Respuesta inmune

La presencia de Brucella spp. induce los mecanismos de defensa corporales de la inmunidad innata, tales como la vía clásica de complemento y acción de los neutrófilos y macrófagos. Esto son los mecanismos generales de resistencia a las bacterias Gram negativas. Los neutrófilos son las primeras células que hacen contacto con la Brucella. Los anticuerpos realizan la opsonización de los microbios, lo cual activa al complemento y facilitan la fagocitosis. La Brucella spp. puede sobrevivir y multiplicarse dentro de los neutrófilos durante el curso de la infección y a través de estas células, los microbios son transportados a los tejidos linfoides. Para matar a las bacterias intracelulares es necesario afectar la desgranulación de los neutrófilos, con la subsecuente liberación de la mieloproxidasa. Los neutrófilos reaccionan de manera diferente a la Brucella spp. en las distintas especies animales, ya que la bacteria tiene mecanismos más o menos eficaces para inhibir la desgranulación y así prevenir su propia destrucción. La activación clásica del complemento puede iniciarse con la presencia de bajas concentraciones de IgM e IgG antilipopolisacaridos (LPS), manejando así la lisis bacteriana [106]. Los macrófagos conforman un grupo celular que interactúan con la Brucella spp. de manera particular. La interacción entre los receptores de membrana y los LPS inducen la producción de interleukina-12 (IL-12), estimulando a las células asesinas naturales (células NK) y los linfocitos T ayudantes (LTh) CD4+ los cuales secretan el interferón-γ (IFN-γ), favoreciendo el desarrollo de una respuesta inmune mediada predominantemente por LTh1. Este subgrupo de linfocitos T estimulan principalmente la respuesta celular y están directamente involucrados en la protección contra los microbios intracelulares, debido a su amplia gama de citoquinas incluyendo IL 2, 3, 6, 12, factor de necrosis tumoral-α (TNF-α) y especialmente IFN-γ, que es esencial para la activación de los macrófagos [107,108]. Cuando los microbios son fagocitados, los macrófagos tienen la capacidad de destruirlos inmediatamente, pero como se ha descrito para los neutrófilos, la Brucella spp. es capaz de inhibir estos mecanismos destructivos [109]. Sin embargo los resultados de la expresión de la citoquina en los búfalos infectados con Brucella abortus no fueron concluyentes [110] y ameritan más estudios. La progenie de búfalos seropositivos tuvo 6,2 veces más propensos a tener anticuerpos séricos desarrollados por el momento del primer parto que la progenie de búfalos seronegativos [111].

11. Muestreo

Todos las muestras destinadas al aislamiento bacteriano deben recolectarse cuidadosamente y deben almacenarse a 4°C. El embalaje utilizado para el transporte debe ser impermeable, recomendándose el empleo de un contenedor triple para prevenir la exposición humana. El tiempo entre el muestreo y su llegada al laboratorio no debe exceder las 12 horas. Las muestras que pueden ser destinadas para el aislamiento de organismos incluyen la leche, frotis vaginal, sangre, membranas fetales, fetos y órganos fetales. Para el diagnóstico serológico, las muestras de sangre se obtienen por punción de la vena yugular o coccígea, recolectadas en tubos bien identificados que deben ser remitidos al laboratorio en un recipiente hermético y refrigerado [112].

12. Profilaxis

Para prevenir la brucelosis en búfalos, se emplean las mismas vacunas utilizadas actualmente en la prevención de la brucelosis en el bovino. La cepa-19 (S19) de B. abortus es una vacuna viva aplicada en dosis única subcutánea a una dosis de of 8-5× 1010 microorganismos viables [67,113,114]. La S19 (patogénica) es una cepa lisa, así que los anticuerpos generados en respuesta a la vacuna, son detectados por la mayoría de las técnicas convencionales de diagnóstico, por lo que se recomienda su aplicación en novillas entre 3 a 8 meses de edad. La duración de la inmunidad de la vacuna S19 en ganado es de 5-6 años. Los estudios que compararon la vacunación con s19 entre novillas de búfalo y bovino menores de 8 meses de edad, demostraron que la persistencia de IgG e IgM fue más larga en el búfalo [115]. Afzal y colegas encontraron que la administración de la vacuna S19 en novillas de búfalo entre los 6 y 12 meses de edad, la IgG persiste por más tiempo en los animales más viejos, aunque no se observó diferencia significativa cuando se utilizaron dosis bajas de esta vacuna [113]. Se ha sugerido la administración de dosis reducidas de S19 por vía conjuntival para ser utilizadas en fincas infectadas con Brucella [13].

Se ha informado en el pasado que una vacuna de Brucella abortus cepa rugosa 45/20 muerta confirió un grado significativo de protección a búfalos egipcios contra la brucelosis [116] aunque su utilización posterior no se ha documentado y la S19 continúa siendo la vacuna de elección en muchos países.

La vacuna RB51 es una cepa atenuada, rugosa, mutante y estable derivada de la cepa 2308 de B. abortus, la cual a diferencia de la S19 no tiene cadena de lipopolisacarida O en la superficie [116]. Esta vacuna ha sido utilizada en varios países en diferentes concentraciones, edades y esquemas de vacunación con resultados variables, pero hay consenso en que el uso de esta vacuna no interfiere con la detección de animales serológicamente positivos con técnicas convencionales [65,117-119]. Sin embargo, la vacuna es considerada potencialmente peligrosa para la vacunación de búfalas adultas ya que es excretada en la leche durante varios días posteriores a la vacunación [120]. Adesiyun y col., [19] compararon la patogenicidad de la cepa de B. abortus aislada de ganado y búfalos y observaron que las recolectadas de búfalos eran menos virulentas en el modelo en ratón, sin diferencias histopatológicas. La continuidad de estos estudios puede ser útil para mejorar la prevención; especialmente en países en donde la población de búfalos sigue aumentando [19].

El uso de tratamientos antibióticos para el control de la infección con Brucella solo se recomienda en humanos, ya que las vacunas que actualmente están disponibles son para su uso en animales. Dadas las características intracelulares de la bacteria, los tratamientos antibióticos no son sencillos y deben seguir las recomendaciones y actualizaciones de la Organización Mundial de la Salud OMS [121]. Como se discutió anteriormente, el uso de las vacunas y programas apropiados de vacunación es un tópico de crucial importancia, ya que la vacunación es uno de los pilares de los programas para el control y la erradicación de la brucelosis en todo el mundo. Es esencial el uso de las vacunas oficialmente aprobadas por cada país.

13. Zoonosis

La brucelosis es una de las zoonosis más diseminadas en el mundo, dado que en humanos hay aproximadamente 500.000 casos por año [122]. La B. abortus está clasificada dentro del Grupo III de Riesgo por la Organización Mundial de la Salud. La infección es considerada como una enfermedad ocupacional en veterinarios, granjeros y trabajadores en la industria empacadora de carne y se adquiere esencialmente por vía oral, respiratoria o conjuntival cuando se manejan animales infectados, fetos abortados o placentas. Los técnicos que trabajan en laboratorios de diagnóstico deben utilizar protección personal y trabajar bajo condiciones estrictas de seguridad cuando manipulan muestras infectadas o cultivos vivos. Otra forma de adquirir la enfermedad es a través de la ingestión de productos lácteos contaminados. En los países donde los búfalos viven con otras especies domésticas e interactúan de alguna manera con los seres humanos, se plantea la necesidad de campañas de prevención y erradicación, enfocadas en ambas especies domésticas y salvajes para reducir la incidencia de la enfermedad en los animales y los seres humanos [123].

En humanos, la enfermedad se manifiesta principalmente como una afección febril aguda (fiebre ondulante) junto con dolor en las articulaciones y muscular, convirtiéndose en crónica comprometiendo a los sistemas musculo-esquelético, cardiovascular y nervioso central. Es necesario implementar medidas públicas de información para disminuir la incidencia de la brucelosis en humanos, mediante el uso de medidas preventivas personales para trabajadores de la industria empacadora de carne, veterinarios y personal de laboratorio. Las maniobras realizadas por los veterinarios en casos de abortos, deben efectuarse utilizando la protección adecuada especialmente cuando se manipulan placentas y fetos abortados, los cuales pueden contener altas cargas bacterianas. Los materiales recuperados de abortos deben destruirse para reducir la diseminación de la Brucella en el medio ambiente [86].

También para las familias que viven diariamente con animales potencialmente infectados con Brucella spp., deben tomar medidas apropiadas de control durante el sacrificio, la ingestión de leche y la producción de productos lácteos, y utilizando cuidados especiales cuando se manejan animales durante el parto. En los países en donde los búfalos están en contacto con especies silvestres y son usados para consumo, deben tomarse así mismo medidas preventivas cuando se manipulan y se come carne de otros animales ya que estos también pueden estar infectados, de acuerdo a los informes de que muchas especies son seropositivas a Brucella [123,124].