Aproximación al diagnóstico de preñez en búfalas

La identificación de manera temprana de las búfalas de leche no preñadas después del servicio puede mejorar la eficiencia reproductiva al acortar los ciclos de animales y servirlos durante la misma estación de monta. El diagnóstico de preñez temprano y preciso parece importante para acortar el intervalo entre partos en búfalas [1] ] las cuales muestran una estacionalidad reproductiva profunda, con una baja manifestación del celo [2]. La disponibilidad del servicio de diagnóstico de preñez parece ser extremadamente baja en algunos sitios [3,4], y en otros lugares la aproximación al diagnóstico parece que está lejos de ser perfecta. Las fallas en el diagnóstico de preñez lleva al sacrificio de búfalas preñadas; una de cada cuatro búfalas sacrificadas está preñada [5] conllevando a cuantiosas pérdidas económicas.

Las características ideales de una prueba diagnóstica de preñez incluyen 1.- alta sensibilidad (i.e., identificación correcta de los animales preñados) ii.- especificidad ( i.e., identificación correcta de los animales no preñados) iii.- bajo costo iv.- fácil de realizar en condiciones de campo y v.- habilidad para determinar la preñez al momento de efectuar la prueba.

Es deseable que el diagnóstico de preñez no solo se haga lo más pronto posible después de la inseminación, sino que una vez hecho el diagnóstico no sea confundido con una posterior muerte embrionaria. La mayoría de los métodos de diagnóstico de preñez directos (clínicos) e indirectos (laboratorio) incluyen una o más de éstas características, pero ninguna de las pruebas disponibles actualmente o en desarrollo incluyen todos los atributos mencionados. Hay dos métodos clínicos de diagnóstico de preñez en búfalas; la palpación transrectal es el método más antiguo y continúa siendo el método más ampliamente utilizado tanto en ganado como en búfalas [6]. Sin embargo, esta aproximación tiene la desventaja que el diagnóstico no es seguro antes de los 45 días [7] y puede ocurrir la mortalidad embrionaria debido a una manipulación brusca de los genitales. Aunque el proceso de ultrasonografía transrectal ha ganado gran popularidad como método clínico de diagnóstico de preñez en búfalas [1,8] aportando información adicional sobre el feto y su entorno, su especificidad y sensibilidad es del 100% solo alrededor del día 30 [1]. Se han desarrollado un gran número de métodos de laboratorio en el diagnóstico de preñez en búfalas que incluyen la detección de hormonas circulantes, moléculas asociadas a la preñez o determinación química de éstas u otras moléculas en las secreciones naturales (moco cervical, orina o leche) de búfalas preñadas, sin embargo, en cualquiera de ellas su detección requiere de un montaje de laboratorio especializado o su sensibilidad y especificidad es baja lo que limita la ampliación de su uso.

En este capítulo los autores clasifican y discuten los métodos de diagnóstico de preñez en búfalas bajo dos encabezados

1. Métodos Clínicos (No retorno al celo, palpación transrectal, ultrasonografía transrectal) y
2. Métodos de laboratorio (Progesterona en plasma y leche, estrógeno plasmático, proteínas asociadas la preñez y pruebas químicas).

1. Métodos clínicos

1.1. No retorno al celo

Después de la concepción, el embrión inhibe la regresión del cuerpo lúteo (CL), mediante la secreción de moléculas que suprimen la secreción de PGF2α, de tal manera que se mantienen altas las concentraciones de progesterona, lo que evita que la búfala retorne al celo. El no retorno al celo en una búfala servida después del día 18 a 24 se presume que el animal está preñado. De otra parte, si la búfala no está preñada después del servicio, el útero segrega PGF2a la cual lisará el CL, las concentraciones plasmáticas de progesterona disminuirán y la búfala retornará al celo después de 21 a 23 días pos-servicio.

La confiabilidad del método depende de la precisión de la detección de celos en el hato. Esta aproximación sobreestima la preñez en un 10 a 20% [9]. El estro gestacional en una pequeña proporción de búfalas preñadas complica igualmente el diagnóstico [9-10]. Los bajos signos de celo y el subestro en algunas búfalas [2] conducen a un error diagnóstico de preñez. Además de la preñez, existen otras circunstancias como la infección uterina crónica o los ovarios quísticos, pueden evitar el estro, siendo diagnosticadas las búfalas erróneamente como preñadas. Las búfalas servidas durante el incremento de días largos pueden fallar en el retorno al celo aunque no estén preñadas [6]. De esta manera la precisión de no retorno al celo como indicador de preñez es baja en búfalas [9]. Se ha reportado un aumento en la mortalidad embrionaria durante los períodos de días largos en búfalas [11-12]. Esto puede incrementar el intervalo entre la inseminación y el retorno al celo en búfalas que mantienen una preñez por algún tiempo y luego pierden la preñez cuando la estación de monta ya ha pasado.

1.2. Palpación transrectal

La palpación transrectal ha sido empleada en el diagnóstico de gestación en ganado en el inicio de los 1900 [13] y ha sido el procedimiento más habitual de diagnóstico en campo. Debido a la gran similitud con el ganado, se ha empleado también en búfalas el mismo método. Durante el examen rectal, se palpan el ovario y el útero a través de la pared rectal. La presencia de CL, no necesariamente indica preñez y su detección en el ovario de la búfala es difícil, puesto que está más profundamente embebido en el estroma ovárico y se proyecta menos en la superficie del ovario [14]. Los hallazgos positivos de preñez incluyen la palpación del aumento de tamaño del útero, vesícula amniótica, deslizamiento de membranas fetales, placentomas, feto y el aumento de grosor de la arteria uterina media durante los diferentes estados de gestación [6] (Tabla 1 & Fig. 1A, Fig. 1B, Fig. 2, Fig. 3, Fig. 4 y Fig. 5). Otros estudios han mencionado previamente los diferentes cambios durante los tres trimestres s de preñez en la búfala [9].

La palpación transrectal se utiliza ampliamente y se considera un método seguro para el diagnóstico de preñez en búfalas. La palpación en búfalas debe efectuarse suavemente ya que la mucosa es muy frágil y sangra fácilmente [6]. La exactitud depende de la experiencia del profesional. La sensibilidad de la palpación a los 31 – 40 días fue del 60%, entre los 41 y 50 días fue del 92% y de los 51 a 55 fue del 100% [7]. Perera [15] informa que la longitud de la gestación es mayor que en el bovino (315 vs 285 días), la cantidad de fluido fetal en el día 31 a 40 puede ser menor en la búfala y esta puede ser la razón para que el diagnóstico temprano de gestación sea mucho más difícil mediante palpación transrectal. La palpación transrectal como método temprano de gestación en la búfala ha sido considerada como precisa a partir de los 46 días después del servicio [7]. El crecimiento progresivo de un feto bufalino (Fig. 5A, Fig. 5B, Fig. 5C, Fig. 5D, Fig. 5E) y de los fluidos fetales y anexos (Tabla 2) producen un aumento en el tamaño del útero. La acumulación del fluido es baja hasta el día 40 después del servicio produciéndose luego un incremento significativo en el volumen de los fluidos fetales y el tamaño del feto con el consecuente aumento del tamaño del útero. El aumento secuencial del tamaño del útero hacia adelante y arriba hace que en conjunto lo muevan hacia la cavidad abdominal. Al sexto mes de gestación, el útero está situado totalmente en la cavidad abdominal y solo pueden sentirse los cotiledones, la distensión uterina y el frémito entre el 5 y 7 mes de gestación.

Figura 5A. Día 70. El tamaño del feto es de aproximadamente 7.70 cm.

Figura 5B. Día 80: El tamaño del feto es de aproximadamente 9.50 cm.

Figura 5C. Día 90: El tamaño del feto es de aproximadamente 10.72 a 14.30 cm y su peso es de 57.81 g.

Figura 5D. Día 100: El tamaño aproximado del feto es de más de 20 cm.

Figura 5E. Día 150: El tamaño aproximado del feto es de 24.92 a 34.50 cm y su peso de 275.58 g.

Algunos investigadores [25] informan que el deslizamiento y fluctuación de las membranas fetales dentro del cuerno uterino fueron detectables en la búfala desde cerca del día 42 al 56 de gestación; Por medio de la palpación transrectal es difícil distinguir entre una preñez temprana y algunas condiciones patológicas que producen asimetría uterina. Agarwal y Tomer [9] reportaron que en la búfala el deslizamiento de membranas puede apreciarse entre los 60 a 90 días de gestación y que la vesícula amniótica puede palparse entre los 30 – 45 días. Sin embargo, la palpación rectal no suministra información sobre la viabilidad del embrión o el feto. Por lo tanto, algunas búfalas con embriones o fetos no viables o en proceso de degeneración pueden ser diagnosticadas como preñadas. Algunas patologías tales como la endometritis crónica o la acumulación de líquidos intrauterinos producen asimetría de los cuernos y pueden ser la razón de otros diagnósticos falsos positivos efectuados por palpación transrectal.

Diagnóstico diferencial de preñez

Parecido a lo que sucede en la gestación, se puede presentar una acumulación de líquido en algunos casos patológicos del útero, como el mucometra y el piometra y pueden crear confusión sobre la existencia de una preñez. Estas condiciones han sido bien reportadas en la especie bufalina principalmente en material de matadero [26-30]. Los clínicos pueden diferenciar tales condiciones por la presencia bilateral de fluidos en el útero, ausencia de deslizamiento de membranas fetales, cotiledones y feto en el mucometra y un engrosamiento de la pared uterina con sensación pastosa en el piometra; sin embargo, la ultrasonografía puede confirmar el diagnóstico en casos de duda. Un examen ecográfico puede revelar la presencia de líquido o pus en la luz del útero y la ausencia de feto. La vejiga distendida llena de orina puede en algunos casos confundirse con preñez. La inducción de la micción confirmará o no la gestación. Se ha reportado un caso muy raro de un parto con feto vivo de una búfala afectada de piometra [31].

1.3. Ultrasonografía transrectal

La ultrasonografía ha ganado gran popularidad en los años recientes como una herramienta diagnóstica en la ciencia veterinaria. Las diversas aplicaciones de la ultrasonografía, el mejoramiento de la calidad de la imagen, y la disponibilidad de ecógrafos portátiles a precios más económicos ha conducido a su aceptación general en la práctica veterinaria. Hay disponibles varios informes sobre la aplicación en tiempo real de la ultrasonografía para el diagnóstico de preñez en búfalas. Se ha reportado una anatomía ultrasonográfica del desarrollo del feto del día 18 al 60. Se ha revisado y descrito en detalle la aplicación del proceso de la ultrasonografía transrectal para la investigación reproductiva en la búfala [1,8,32-37]. Las búfalas son introducidas en un brete y se evacuan las heces del recto. Se introduce en el recto la sonda (5.0 – 7.5 MHz) envuelta en un guante, se lubrica con gel y se escanean secuencialmente ambos ovarios y cuernos uterinos.

La apariencia de las diferentes partes del feto y anexos fetales es gradual en la búfala (Fig. 6). La indicación más temprana de preñez es la visualización de la vesícula amniótica en el día 19. Esta aparece como un área anecogénica (Fig. 7A) algunas veces con un embrión ecogénico visible. La vesícula inicialmente es esférica y luego comienza a elongarse y a ser de forma irregular alrededor del día 26 (Fig. 7B). Hay variabilidad en el grado de elongación de la vesícula entre búfalas. El alto de la vesícula amniótica aumenta de 11.7 mm en el día 19 a 33 mm en el día 40 y a 63.8 mm en el día 60 [8]; La primera detección del embrión se efectuó en el día 19 en la búfala. El crecimiento del embrión se incrementa con regularidad desde 4.2 mm en el primer día de detección a 53.6 en el día 62.

Figura 6. Días de la primera detección por ultrasonografía de las características identificables del conceptus de la búfala entre los días 18 a 60.

Figura 7A. Día 19: embrión dentro de la vesícula amniótica (flecha).

Figura 7B. Día 26: embrión de 9.1 mm de largo y alantoides visible (flecha).

Sobre el día 34, el amnios es visible y rodea el embrión (Fig. 7C). En el día 42 es visible el embrión, diferenciándose la cabeza, el tronco y los rudimentos de los miembros (Fig. 7D) ), los que son claramente visibles en el día 44 (Fig. 7E). En el día 50 puede verse claramente las uniones placentarias (Fig. 7F). En el día 55, son visibles los huesos de las costillas como líneas ecogénicas blancas (Fig. 7G)mientras en el día 62 se distinguen claramente la cabeza, área óptica, miembros anteriores y posteriores del embrión (Fig. 7H).

Karen y col., [1] informaron que en condiciones de campo, la sensibilidad de la ultrasonografía transrectal entre el día 19 a 24 fue del 44%. Es difícil detectar una pequeña cantidad de líquido amniótico entre el día 19 a 24 de gestación lo que produce con mucha frecuencia diagnósticos de falsos negativos. La sensibilidad de la prueba se incrementa desde el día 25 alcanzando el 100% desde el día 33 -35 de gestación.

Figura 7C. Día 34: es visible el amnios rodeando al embrión como un círculo blanco ecogénico (flecha).

Figura 7D. Día 42: embrión con diferenciación de la cabeza, tronco y miembros.

Figura 7E. Día 44: embrión con diferenciación clara de cabeza, tronco y miembros.

Durante la ultrasonografía, es difícil la identificación temprana del embrión debido a su posición, la cual era muy cercana o en estrecho contacto con la pared uterina [35-36]. En la búfala, la detección del latido cardíaco es un punto importante en el diagnóstico de preñez por ultrasonografía, ya que nos permite evaluar la viabilidad del embrión [36].

Figura 7F. Día 50: embrión con unión placentaria.

Figura 7G. Día 55: embrión con costillas y miembros posteriores.

Figura 7H. Día 62: concepto con feto de búfala totalmente distinguible, con cabeza, área óptica, miembros anteriores y posteriores.

La apariencia ultrasonográfica de las diferentes estructuras en varios estudios (Tabla 3) revela que el feto y los latidos cardíacos son visibles en el día 25 a 29, mientras que las otras estructuras fetales comienzan a ser secuencialmente visibles.

El ultrasonido en tiempo real (modo B) es un método confiable y relativamente simple de diagnóstico de preñez hacia el día 25 a 30 en búfalas. Dos factores afectan la velocidad a la cual puede conducirse el examen ultrasonográfico en hatos de leche: 1) La capacidad y competencia del operador y 2) contención de la búfala. Cuando ambos factores son optimizados, la velocidad del examen ultrasonográfico puede asemejarse al de la palpación rectal, mientras que excede a la palpación rectal en la cantidad de información recogida de cada búfala. La principal ventaja del escaneo ultrasonográfico es que suministra un diagnóstico preciso más temprano que la palpación rectal.

Aunque la exactitud de la ultrasonografía en el diagnóstico de preñez es alta en el día 30 [7], los clínicos pueden considerar el reexamen de las búfalas evidenciando los signos positivos de preñez en el día 30 y de nuevo el día 60 por la posibilidad de muerte embrionaria temprana (que ocurre frecuentemente entre los días 28 – 60 [12] y que puede conducir a errores diagnósticos.

1.4. Resistencia eléctrica vaginal

La conductividad del flujo de corriente en la vagina aumenta durante el estro debido a la disminución en la resistencia hacia el paso de corriente de bajo voltaje, por el incremento de flujo sanguíneo y la hidratación en la mucosa vaginal. La medición de la resistencia eléctrica vaginal (VER) se ha medido en varias especies a través de sondas comerciales en un esfuerzo de detectar celo. El monitoreo diario de la VER en la vaca [42-44] y la búfala [45-49] revela que esta disminuye durante el estro. La caída de la progesterona fue sincrónica con la caída de VER, siendo positiva y significativa la correlación (0.65) entre ellas [47]. Las más altas tasas de concepción en búfalas se presentaron cuando fueron inseminadas con una VER entre 26-30 Ohms [48]. Cuando los animales son examinados diariamente, los animales que retornaron al celo mostraron una caída de la VER mientras los animales preñados continuaron mostrando consistentemente una VER alta. Sin embargo, debido a muchas variables de confusión y una menor hidratación en la vagina bufalina durante el celo y por los requerimientos de mediciones diarias con la sonda, tal aproximación parece menos práctica y por lo tanto no ha ganado popularidad para el diagnóstico de preñez en la búfala.

2. Pruebas de laboratorio

Los métodos indirectos para el diagnóstico de preñez utilizan medidas cuali- y cuantitativas de las hormonas reproductivas en etapas específicas después de la IA o la detección de sustancias específicas del conceptus en los fluidos corporales maternos como indicadores indirectos de la presencia de una preñez viable. Continúan las investigaciones de los métodos indirectos de diagnóstico de preñez puesto que estos métodos no son invasivos y las pruebas pueden comercializarse y ser realizadas por los granjeros de la lechería o los trabajadores de la finca. Actualmente, los métodos disponibles o los métodos en desarrollo para el diagnóstico de preñez incluyen la medición de hormonas endocrinas tales como la progesterona, estrógenos y proteínas específicas de la preñez tales como las glicoproteínas asociadas con la gestación o el factor temprano de preñez y unas pocas pruebas químicas.

2.1. Prueba hormonal de progesterona

En la búfala, el cuerpo lúteo formado en el ovario luego de la ovulación produce progesterona para el mantenimiento de la preñez durante la gestación [50]. La concentración de la progesterona en sangre está en su punto más bajo (0.1 a 0.3 g/ml) durante el celo y se mantiene cerca de 1 ng/ml durante los siguientes 3-4 días [51]. El primer aumento significativo en las concentraciones de progesterona ocurre cerca de los 7 días después del estro [52]. Se han reportado valores pico de progesterona de 4.0 a 5.1 ng/ml [51,53-54] alrededor del día 15 después del celo.

En una búfala ciclando, el cuerpo lúteo regresa como consecuencia de la liberación de prostaglandinas (PGF2α) producida por el endometrio uterino. Si la búfala no está preñada, los niveles de progesterona disminuyen. Por consiguiente, las bajas concentraciones de progesterona en la sangre materna en el día 18 a 24 post servicio puede predecir que la búfala no está preñada y las concentraciones altas de progesterona en este momento indica una posible preñez. Las bajas concentraciones de progesterona en el día 18 a 24 pos-servicio puede predecir con seguridad la no preñez en una búfala cíclica, mientras que la mayoría de las veces que se obtienen altas concentraciones de progesterona durante este período no es un indicador específico de preñez debido a la variación en la longitud del ciclo estral entre búfalas, mortalidad embrionaria o patologías uterinas que llevan a la persistencia del cuerpo lúteo y quistes lúteos.

Tanto las pruebas de progesterona en plasma/suero [51,55-66] y leche [67-77] han sido empleadas en el diagnóstico de preñez en búfalas. Se ha utilizado radioinmunoensayo (RIA) [78-81] y la prueba de Inmunoanálisis enzimático (ELISA) [82-83]. Un período estral más largo y la gran variabilidad en la longitud del ciclo estral contribuye a la proporción de diagnósticos falsos [70]. La exactitud el 100% para el diagnóstico de búfalas no preñadas en unos pocos informes [70,80,84] no han sido validadas en otros estudios (Tabla 4). El promedio de la progesterona en suero/plasma durante la preñez temprana varía de 1.0 a 3.95 ng/ml un día después de la preñez [9]. La progesterona en leche es 4-5 veces más alta en comparación a la progesterona en suero/plasma. [85-86] (Tabla 4).

La especificidad de la prueba de progesterona en el día 21 fue solamente del 66.70% o 75% [56,67]. ]. La concentración de progesterona en leche o suero puede cuantificarse empleando la técnica de RIA o ELISA. Kaul y Prakash [73] informaron de una precisión de diagnóstico de preñez en búfala de 57%. 69.50% y 75% en el día 20, 22 y 24, respectivamente.

La principal ventaja de utilizar las concentraciones plasmáticas de progesterona para el diagnóstico de preñez, es que éste método permite detectar búfalas no preñadas muy pronto después de la inseminación. Sin embargo, se presentan varias desventajas en la estimación de la progesterona para el diagnóstico de preñez. La búfala con problemas reproductivos, ejemplo infección uterina o un ovario con quiste lúteo, puede en consecuencia tener altas concentraciones de progesterona y puede confundir el diagnóstico. Algunas veces la estimación de progesterona post servicio dan un resultado positivo de preñez, sin embargo, la muerte embrionaria que ocurra entre los días 30 a 40 post servicio conduce a errores de diagnóstico.

Aunque las pruebas cuantitativas de progesterona efectuadas en laboratorios regionales al igual que las pruebas cualitativas de campo han estado disponibles en la industria lechera durante muchos años, la prueba de progesterona como método indirecto para el diagnóstico de no preñez no es una práctica difundida entre criadores de razas bufalinas. Las razones específicas para limitar la implementación de esta tecnología en vacas y búfalas puede incluir su menor grado de precisión y el costo de las pruebas.

2.2. Sulfato de estrona

El sulfato de estrona es un estrógeno conjugado que se ha utilizado para el diagnóstico de gestación empleando muestras de leche en la vaca. [92]. A diferencia de la concentración de progesterona, ésta está directamente relacionado con la preñez. El sulfato de estrona es producido por el eje feto-materno o el conceptus y por lo tanto su presencia en la orina, leche, heces o sangre es un indicativo de preñez [92]. El pico de concentración de estradiol (30-35 pg/ml) fue detectado en búfalas hacia el día del estro o un día antes [93] seguido por un descenso a 5-10 pg/ml, dentro de los 2 días siguientes. Las concentraciones de estradiol circulante permanecen bajas durante la fase lútea con menores fluctuaciones (10-20 pg/ml) alrededor de los días 4 y 10 del ciclo estral en búfalas [93].

El día más apropiado para la detección del sulfato de estrona en búfala es el día 150 de gestación en suero [63,94]. En un estudio previo [95], se reportó el incremento progresivo de las concentraciones de sulfato de estrona en plasma de búfala después del 4° o 5° mes de preñez. Sin embargo, un estudio reciente describe un descenso del estradiol en plasma durante el segundo trimestre (3-6 meses) de preñez en comparación al primer trimestre de preñez. Los perfiles de estradiol en búfalas Murrah preñadas (10.71 + 2.25 pg/ml) no fue significativamente más alta en comparación con las no preñadas (20.71 + 3.82 pg/ml en el día 22 después del servicio [97]. Los niveles de estrógeno permanecen elevados durante el período de gestación y alcanzan un pico de 129.33 + 33.38 pg/ml cerca al parto [91]. El perfil de estradiol se incrementó considerablemente el día del parto seguido de una caída significativa posparto [98]. El perfil de estradiol en búfalas Jaffarabaadi durante el primer, segundo y tercer semestre de gestación fue de 10.0 + 4.54. 43.43 + 18.36 y 101.53 + 32.79 pg/ml respectivamente [91].

Por esta razón, el diagnóstico de preñez en búfalas utilizando sulfato de estrona no es confiable. Hamon y col., [99] informaron que en la vaca las concentraciones de sulfato de estrona en la circulación materna no son confiables de detectar hasta alrededor de los días 80 de gestación y no está presente en todas las vacas preñadas hasta el día 100 de gestación; el sulfato de estrona no puede competir con la progesterona para estimar el estado temprano de preñez post servicio.

2.3. Proteínas asociadas a la preñez

Las proteínas producidas y secretadas específicamente por la placenta durante la preñez temprana son obvios candidatos para el desarrollo de una prueba temprana de preñez. Las candidatas promisorias que han sido investigadas a la fecha incluyen las Glicoproteínas Asociadas con la Preñez (PAG) y el Factor Temprano de la Preñez EPF.

2.3.1. Glicoproteínas Asociada con la Preñez (PAG)

Las Glicoproteínas asociadas con la preñez PAGs son proteínas trofoblásticas perteneciente a la familia de la proteinasa aspártica secretada por diferentes células placentarias de muchas especies mamíferas. Las PAGs juegan un papel pivote en la placentogénesis, remodelación de la unidad feto materna e implantación [100-102]. Son sintetizadas por células binucleadas trofectodérmicas BNC, las cuales se originan a partir del epitelio coriónico mononucleado [103]. Las BNC invaden el epitelio endometrial y secretan continuamente PAG durante la gestación [104-105]. Por lo tanto, estas glicoproteínas so buenos indicadores de un concepto vivo [106]. Al igual que otros mamíferos, estas moléculas también se han aislado de la sangre y placenta de búfalas de rio y de pantano [107-111].

Se han aislado dos proteínas específicas de preñez, la A y la B de extractos de membranas fetales de bovino [112]. De éstas, la PSP-A fue identificada como una fetoproteína y la PSP-B se encontró como específica de la placenta. Estas moléculas aparecen en la sangre materna circulante durante toda la gestación y hasta los 100 días posparto.

Karen y col., [1] estudiaron las concentraciones de PAG utilizando RIA con anticuerpos dobles heterólogos para el diagnóstico de preñez en búfalas entre el día 19 a 55 pos-servicio y sugiere que la prueba de RIA para la detección de PAG es ampliamente confiable para detectar preñez en búfalas más allá del día 31 después del servicio. La sensibilidad y especificidad de la prueba fue del 11.1% y 92.5% respectivamente en el día 19-24 pero se incrementa al 100% en el día 31-35. Barbato y col., [109] estudió las concentraciones de las PAGs en búfalas y observaron que durante la preñez, las concentraciones de las PAGs fueron detectadas en la semana 6 (9.9±07 μg/ml), las cuales se incrementan gradualmente hasta la semana 28 (68.2±20.8 μg/ml). Al parto, el promedio de las concentraciones fue de 84.70 ±10.6 μg/ml disminuyendo luego rápidamente y alcanzando niveles muy bajos (<1.0 μg/ml) una semana después del parto. En un estudio [113], la PSP-B fue detectable en el 33% de las búfalas preñadas en el día 20 a 25 de gestación, mientras que el 91% de búfalas preñadas tuvieron niveles de PSP-B más altos que el umbral para el diagnóstico de preñez en el día 37 de gestación. Las proteínas de la preñez son sintetizadas por las células binucleadas originarias del trofoblasto [114], las cuales comienzan a migrar dentro del endometrio alrededor del momento de la fijación final del feto. Los niveles de PAG fueron bajos en el día 19 a 24 de gestación, dando lugar a una alta frecuencia de diagnósticos falsos negativos. Las limitaciones para ampliar la utilización de esta prueba es la no disponibilidad de la proteína en leche y orina, y la presencia de PAG luego del día 100 posparto lo cual puede interferir con la detección posterior de una preñez temprana. Abdulkareem y col., [117] evaluaron el empleo de una prueba comercial disponible de ELISA para PAGs en la detección de preñez en búfalas y encontró que mediante una prueba cuidadosa de PSP-B, si la búfala era detectada no preñada, la prueba era correcta en el 99% de las veces. Si era detectada como preñada, la prueba era correcta en el 91-94% de las veces. La diferencia en los resultados se debe a las pérdidas embrionarias que ocurren antes de que pueda realizarse una segunda prueba confirmativa.

2.3.2. Factor temprano de preñez

Esta molécula proteica se identificó primero en ratones preñados [118] ] y luego en ovejas y vacas [119,120] y en búfala [121] utilizando el bioensayo de inhibición de roseta. Con esta prueba, el factor temprano de preñez se detectó en el suero de todos los mamíferos muestreados dentro de las 24 a 48 horas de la fecundación y desapareció dentro de las 24 a 48 horas después de la muerte o remoción del embrión [118]. Puesto que la prueba de inhibición de roseta para EPF es indirecta, las sustancias que tienen efectos similares pueden producir resultados confusos. Un número de estudios en el año después del descubrimiento de EPF fueron incapaces de reproducir la detección consistente de EPF en hembras post-concepción y la validez de la prueba fue baja requiriendo ser sustancialmente mejorada.

2.4. Pruebas químicas

2.4.1. Prueba del hidróxido de sodio

Esta prueba consiste en hervir 0.5 ml de moco cervical con 5 ml de hidróxido de sodio 10% durante 6 minutos. El desarrollo de una luz de color marrón claro es indicativo de preñez, mientras que un amarillo pálido indica ausencia de preñez. Revisando los reportes del uso de esta prueba en vacas [122-123], se hizo la prueba en 110 muestras de moco cervical recolectado en el matadero de genitales de búfalas Murra y Nagpuri [124]. La prueba alcanzó solo el 44% de precisión en búfalas con preñez temprana, mientras que las búfalas no preñadas fueron diagnosticadas correctamente en un 77.77%. La baja precisión de la prueba y la dificultad en la obtención del moco cervical limita la ampliación de su uso. De manera similar, una baja precisión en el test de la gravedad específica del moco cervical en búfalas (la cual se presume se incrementa en búfalas preñadas) [124] precluye la ampliación de su uso.

2.4.2. Prueba del cloruro de bario

El principio de la prueba es que la progesterona presente en la orina durante la preñez previene la precipitación del cloruro de bario mientras que los estrógenos favorecen la precipitación [125-126]. Se añaden 5 a 6 gotas de solución de cloruro de bario al 1% a 5 ml de orina e un tubo de ensayo y se mezclan. Si no hay precipitación, la prueba indica preñez. Una precipitación blanca clara indica no preñez. La precisión de la prueba fue del 70-95% en estudios iniciales en vacas [125,127-128] entre los días 15 a 210 de preñez; sin embargo, estudios posteriores en vacas [129-130] registraron solo 64-80% de precisión. En estudios en búfalas [124] la precisión de la prueba fue solo del 68-96% durante la preñez temprana y 100% al final de la preñez. En los animales no preñados la precisión fue solamente del 52%. La baja precisión de la prueba hizo que se impidiera su uso a gran escala. Una limitación importante de éste método es la presencia de un cuerpo lúteo persistente debido a infecciones uterinas las cuales pueden producir falsos positivos.

2.4.3. Prueba del sulfato de cobre en leche

Esta prueba consiste en adicionar 10 ml de Sulfato de Cobre al 3% a 5 ml de leche en un tubo de ensayo. La coagulación de la leche indica preñez mientras que si la leche permanece homogénea por varias horas, entonces es indicativa de no preñez. El promedio de precisión de la prueba en 249 muestras fue de solo 64.24% [124].